骨細胞の細胞外環境変化におけるグルコース輸送担体とモノカルボン酸輸送担体の役割

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22592045
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 坂倉 康則 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (60128915)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 入江 一元 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70223352) ; 渋井 徹 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (80453265) ; 高橋 昌己 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (50550307)
• Keywords: 骨芽細胞 / 骨細胞 / 低酸素応答因子 / グルコース輸送担体 / モノカルボン酸輸送担体

Research Abstract

当該年度の計画通り、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞MC3T3-E1細胞(5x10^4個)を24穴のMultidishに播種し、通常培養条件(5%CO_2+95%空気)下で3日から7日間培養した。各培養期間での細胞の形態学的特徴を観察するために固定し0.5%トルイジンブルーで染色した結果、細胞数自体は増加し一部にやや重層する部位がみられるが、この培養期間では大きな特徴はなった。一方、RT-PCR解析によるhypoxia inducing factor(HIF)は発現し続け、glucose transporter 1(GLUT1)はユビキタスに発現したが、GLUT3はほとんど発現していなかった。これは、通常の培養条件下(細胞培養に適した酸素濃度とグルコース濃度の条件)ではこれまで組織学的に観察されてきた結果に対応するものであり、GLUT3の発現状況から細胞は活発に酸化的リン酸化を介して呼吸をおこなっていると考えられる。ただし、HIFの遺伝子は発現しているものの、プロテオソーム系で分解されているものと考えられ、HIFが安定化していないことについてはWestern blotにて確認する必要がある。現在、GLUT5の発現状況とhouse-keeping遺伝子GAPDHを基準にした比較検証している。一方、免疫組織化学的に染色した結果、RT-PCRでの発現状況を反映するような結果となった。しかしながら、骨細胞様細胞MLO-Y4については培養に不慣れであり、思うように実験が実施できていない。加えて、低酸素での培養条件という厳しい環境で長期間の安定的培養に苦慮していることから、実質的に培養が継続できていない。また、この低酸素培養条件での培養の改善策の模索のために、monocarboxylate transporters(MCTs)の発現解析は進んでいない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

低酸素での培養条件という厳しい環境で長期間の安定的培養に苦慮していることから、実質的に培養が継続できていない。

Strategy for Future Research Activity

低酸素での培養条件という厳しい環境で長期間の安定的培養に苦慮していることへの対応策については徐々に培養環境に順応させていくように工夫する。実験培養期間が長くなるが、5%CO_2+95%空気の環境から急に低酸素環境下に移すのではなく、15%～5%O_2濃度へと徐々に慣れさせていくように計画をマイナー的に変更する。それでも結果が得られないようであれば、15%O_2あるいは10%O_2での培養条件下で検討する。