2010 Fiscal Year Annual Research Report
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22592080
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
千葉 忠成 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (60350138)
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| Keywords | 発現ベクター / MALT1遺伝子 / 細胞増殖能 / 浸潤・転移能 |
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| Research Abstract |
本研究では、MALT1による細胞増殖能、浸潤・転移能を指標に関連遺伝子を含めた制御因子の探索と機能解析を行うことを目的とする。研究期間中にMALT1の各機能ドメインの欠失タンパク質発現ベクター(FLAG tagおよびGFP tagを導入済み)を細胞に導入し、免疫染色、ウエスタンブロット、蛍光顕微鏡にて観察し、核内・核外輸送に関連する部位を特定する。MALT1の3'-UTRを介したmiRNAの抑制効果について検証する。Tet(ON/OFF)制御システムで構築したMALT1発現制御癌細胞をマウスに移植し、細胞増殖能および浸潤・転移能の解析を行う。
本年度は以下のようなMALT1の機能ドメイン欠失タンパク質発現ベクターの構築を行った。<完全長MALT1(WT)、deathドメイン欠失MALT1(IgG-CASPASE)、deathドメイン-IgGドメイン欠失(CASPASE)、caspase-likeドメイン欠失MALT1(D-IgG)、death/caspase-likeドメイン欠失MALT1(IgG)、IgG-caspase-likeドメイン欠失MALT1(D)>動物細胞発現ベクターのpCI-FLAG-neoおよびpCI-GFP-neoにMALT1能ドメイン欠失タンパク質遺伝子を導入した。MALT1の完全長cDNAをテンプレートにし、MALT1の機能ドメイン配列をPCRで増幅し、クローニングベクターのpCR2.1にサブクローニングした。次に目的の遺伝子フラグメントを制限酵素で切断し、pCI-FLAG-neoおよびpCI-GFP-neoに組み換えた。構築したプラスミドを精製し、HEK293細胞に導入後、ウエスタンブロット法により目的のタンパク質を確認した。WT、CASPASE、D-IgGの発現ベクターに関しては、HSC2細胞に導入し、発現安定株を樹立した。
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