FGF-2誘導性再生歯根膜における末梢神経ネットワーク再構築

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22592310
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 佐保 輝之 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (10263295)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北村 正博 大阪大学, 大学院・歯学研究科, 准教授 (10243247) ; 柳田 学 大阪大学, 大学院・歯学研究科, 助教 (80379081)
• Keywords: FGF-2 / 再生医学

Research Abstract

FGF-2により再生された歯根膜組織が、咬合力などの外力を感知し、咀嚼を制御する歯根膜の神経生理学的な機能を再現しているか否かという、これまでほとんど注目されていなかった歯周組織再生における歯根膜の末梢神経ネットワーク再構築に関してFGF-2により再生した歯根膜組織と正常歯根膜組織の神経線維を免疫組織学的に比較検討することにより評価することを目的として研究を開始した。H22年10月の科研費追加採択後、本年度は歯根膜組織内の神経線維をネットワークとして評価できる免疫組織染色法の確立を目指し、ビーグル犬から採取した歯を含む正常歯周組織を、中性緩衝ホルマリン液で浸潰固定した後、蟻酸溶液で脱灰した。そして、ショ糖溶液で浸漬した後、コンパウンドに包埋し、クリオスタットで凍結切片を作製した。切片をPBSで洗浄後、過酸化水素水を含むメタノールで処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化した。そして、PBSで洗浄後、神経特異的蛋白であるNeurofilament Protein (NFP)に対する抗体を加え反応させた。再度、PBSで洗浄後、ビオチン標識IgG抗体を反応させ、洗浄後ABC complexを加え反応させた。そして、Horseradish peroxidaseを3,3-diaminobenzidineと過酸化水素水を含むトリス塩酸緩衝食塩水で発色.可視化し、硫酸ニッケルアンモニウムで増感した。反応後、切片はスライドガラスに貼付し、風乾後メチルグリーンで対比染色し、上昇エタノール系列で脱水、非親水性溶媒で透徹後封入し、光学顕微鏡で観察した。その結果、NFP陽性線維が検出されることが明らかとなった。現在、至適な切片の厚さ並びに抗体濃度その他各種条件を検討中である。