細菌 non-coding RNAのカタログ化とカスタムアレイの開発

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22592320
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部 (80246917)
• Keywords: 歯周病 / 診断 / アレイ / 臨床サンプル / non-coding RNA / 細菌 / ストレス / カタログ化

Research Abstract

今までの研究から、歯周病進行の危険度を予測する診断用カスタムアレイの開発を進める上で、臨床サンプルのような微量で非常に分解し易い細菌RNAを扱うのに、mRNA保存状態が解析結果に大きく影響を与えた。そこで本研究は、細菌の病原性発現に関連性が高く、かつ、分解されにくい細菌small non-coding RNAに着目し、新たにアレイプローブとして使用する事で、分解されやすいような臨床サンプルにおいても、安定して解析可能な歯周病病態・診断予測マーカーの探索を行なえるのではないかと考えた。small non-coding RNAのカタログ化を試みるために、代表的な歯周病病原細菌の研究株に対して種々のストレス等をかけた後、全RNAを抽出した。Bioanalyzerにて精製した全RNAのクオリティを確認した。RIN値9.0未満の場合には、断片化されたmRNAが多量にnon-codingRNAサイズ領域に混入してる可能性が高いと判断してRNA抽出をやり直した。それ以外は同機器用のsmall RNA診断チップを用いて試料中に推定されるnon-coding RNAの全RNAに対する比率を測定した。全RNAからその中の90%以上を占める16Sおよび23S rRNAを除去し、細菌mRNAおよびnon-codingRNA-richサンプルを作成した。flashPAGE Fractionatorを用いて、サンプルの電気泳動を行い、20-150ntサイズ程のsmall RNA領域をゲルから抽出・精製した。microRNA CloningKitを用いて、各実験系500～1,000程度のクローンを拾い上げ、シークエンスを行って、non-coding RNAであるかの予測を行なっている所である。