細菌 non-coding RNAのカタログ化とカスタムアレイの開発

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22592320
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (80246917)
• Keywords: 歯周病 / 診断 / アレイ / 臨床サンプル / non-coding RNA / 細菌 / ストレス / カタログ化

Research Abstract

近年、遺伝子の発現量を網羅的に観測する技術の1つとして、マイクロアレイとは別に高速シークエンサーによる解読が進んでいる。本研究当初から予定し、行っているnon-coding RNAの全RNAからの分離、クローニング、塩基配列の解読の流れによるカタログ化の試みは、膨大な時間と手間がかかり、マイクロアレイ作製のための充分なカタログ化には至っていないのが実情である。そこで、より効率的な方法の1つとして、高速シークエンサーによるnon-coding RNA配列のカタログ化を試みた。
P.gingivalis W83株をCold shock stress(15℃)、Heat shock stress(45℃)、アルカリストレス(pH9.5)、酸性ストレス(pH5.0)、および酸素ストレス下に30分間曝した後、全RNAを抽出した。各全RNAを等量ずつ取り、1つに混合したのち、約85%を占める23S rRNAと16S rRNA、および5S rRNAやtRNAを含む100bp以下のRNAを除去し、mRNA-rich試料を作成した。この試料中に存在する全てのRNAの塩基配列を解読する事で、結果的に100bp以上の様々なストレス下で発現するnon-coding RNAを網羅的に解析した。本試料を高速シークエンサー(illumina HiSeq 2000,イルミナ社製)にて、30億リードペアで解読した。現在塩基配列のベースとなるW83株の染色体DNA上での位置関係を解析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画では、non-coding RNAのカタログ化の効率が極めて悪かったため。

Strategy for Future Research Activity

細菌のnon-coding RNAのカタログ化に対しては、全RNAからrRNAを除去し、泳動後のゲルから切り出し、クローニング後に塩基配列を解読するといった当初の計画では、膨大な時間と手間がかかり過ぎて、マイクロアレイ作製のために充分にカタログ化するには効率が極めて悪かった。そこで対応策として、より効率的な方法の1つとして、高速シークエンサーによるnon-coding RNA配列のカタログ化を試みている。