Research Abstract |
アルツハイマー病(AD)の原因物質である42残基のアミロイドβペプチド(Aβ42)は,凝集することによって神経細胞毒性を示す.近年,凝集中間体であるオリゴマー(2~4量体)が記憶異常を誘導する毒性本体とされることから,オリゴマーを標的とした阻害剤や抗体の開発が進められている.一方,抗体の長所を保持しつつ短所を補った方法として,核酸アプタマーが注目されている.本研究は,Aβ42のオリゴマーを標的とした核酸アプタマーの開発を目的として,今年度はAβ42の2量体の合成法を確立した. 2量体の合成には,これまでの戦略を見直し,フイスゲン反応(クリックケミストリー)を用いた.架橋部位として,凝集活性に影響の少ないLys28残基に着目し,アジドリジンあるいはプロパルギルグリシンでそれぞれ置換したAβ42変異体を合成した.得られた2種類のAβ42変異体を,t-BuOH水溶液中,銅(I)イオン存在下で1時間反応したところ,予備実験の電気泳動による銀染色法において,2量体に相当するバンドを示唆するデータが得られた.来年度は,大量合成のための反応条件の最適化を行うとともに,架橋部位についてMS-MS解析で確認し,得られた2量体を用いて核酸アプタマーの作製に取りかかる.ところで,2量体形成には,Aβ42自身がラジカル化することが重要であることから,酸化ストレスのAD病態への関与について動物実験で検討した.代表的な抗酸化酵素であるSOD1(細胞質SOD)欠損マウスは種々の老化病態を示す.本欠損マウスとADモデルマウスを交配したところ,得られた二重変異マウスはADモデルマウス単独に比べて,重篤な記憶異常およびオリゴマー形成が認められた.さらに,AD患者脳を用いてSOD1,SOD2,SOD3の量を比較した結果,非AD脳に比べてSOD1のみが有意に低下していた.
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Aβ42は高い凝集性を有することから,Aβ42の2量体の合成はいまだ誰もなし得ていない.研究期間の2年度目に,最大の懸念事項であった2量体の合成に向けて解決の糸口が見えたことより,研究計画はおおむね順調に進展していると判断できる.
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Strategy for Future Research Activity |
前年度までに調製準備の整ったAβ42の2量体を標的としてアプタマーを作製する.アブタマーは,当初RNAで作製することを想定していたが,予備実験により安定性が問題視されたことから,DNAアプタマーに変更する.DNAアプタマーの利点は,ライブラリーを転写する必要がないことから,時間の短縮化ならびにミスリーディングの低減が期待される.検出は,環境への負荷を考慮して,通常アプタマー作製で用いる放射性同位体を用いずに,DNAをフルオレセイン(FITC)で蛍光標識することで行う.得られたアプタマーを用いて,Aβ42の凝集活性及び神経細胞毒性に対する抑制能を評価し,最も高い活性を示したDNAアプタマーについて,ADモデルマウスの脳切片を用いてin situ蛍光実験により,アミロイド老人斑に対する結合能を評価する.
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