2010 Fiscal Year Annual Research Report
In vivoタンパク質複合体形成モニタリングの試み
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22657052
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中山 啓子 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60294972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 典子 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教 (10361073)
舟山 亮 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教 (20452295)
中野 星児 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (00529448)
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| Keywords | タンパク質相互作用 / 蛍光色素 / in vivoモニタリング / Geminin |
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| Research Abstract |
マウス個体(特に発生過程)でのタンパク質の相互作用変化について高い時空間的分解能を持った解析法を確立することを目的に本研究を行った。タンパク質はそれが相互作用する分子により、異なる機能発揮するが、相互作用分子の研究は試験管内で細胞抽出液中を用いた試験管内での結合を調べるに過ぎなかった。そこで、本研究課題では、in vitroで相互作用することが知られている分子群が、in vivoでは、いつ、どこで相互作用するのかを半定量的にモニターする方法を開発することを目指し、発生工学的手法を用いて蛍光タンパク質の断片との融合タンパク質を発現するマウスを作製、in vivoでタンパク質複合体の挙動をモニタリングする。
本研究ではモデルタンパク質としてGemininを用いた。
GemininはCDT1とHoxB9に結合することが知られている。そこで、Geminin・CDT1・HoxB9をそれぞれ異なる蛍光タンパク質との融合タンパク質を作製する。これらの融合タンパク質がこれまでに報告されている機能を持つことを培養細胞内で確認するために、NIH3T3細胞にこれらの融合タンパク質を過剰発現し、細胞周期に与える影響と、これまで報告されている結合タンパク質との結合を免疫沈降法で確認した。また、これらの融合タンパク質を共発現し、想定される蛍光がみられることを確認した。
以上の結果を踏まえて、in vivoでのモニタリングを行うために、lck promoterによって各融合タンパク質のcDNAが転写されるような発現ベクターの構築を終えた。
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