微生物識別用ＲＮＡアプタマーの創製

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22658034
• Research Institution: Toyohashi University of Technology
• Principal Investigator: 菊池 洋 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40273320)
• Project Period (FY): 2010-04-01 – 2013-03-31
• Keywords: ＲＮＡ / 核酸 / 細菌 / 胞子 / プローブ

Research Abstract

昨年度までに、分子間相互作用の速度論的解析（シミュレーション）を基に、静的な結合定数Kdではなく、結合速度定数kONと遊離速度定数kOFFを考慮に入れた方法の開発、これを基に微生物を標的としたRNAアプタマーの創製、また微生物芽胞を標的に、この方法を実行し、複数回のアプタマー選択を行った。その結果新しい方法では、9ラウンドで得られたRNA集団が芽胞に確実に結合していることが確認できた。本年度は、それら集団をクローニングし、共通配列をもとにいくつかのグループに分けることができた。それらクローンから得られた各RNAアプタマーについて結合能の確認を行った。確認の方法は、RNA集団で行った時と同様、調製したRNAを精製し、5’末端を蛍光ラベルした。その精製ラベル化RNAを芽胞標品と混ぜ、結合反応を行った後、蛍光顕微鏡で観察する方法を用いた。対象として、0ラウンド集団、すなわち、選択をまったく行っていないランダム配列RNAを用いた。この0ラウンドRNA集団では、蛍光ラベルRNAが結合した芽胞は、まったく観察されなかった。得られたクローニングによって精製したどのRNA種も芽胞への結合を観察することができた。これら新規RNAアプタマーは栄養細胞には全く結合せず、芽胞のみに結合した。異なった数種の菌の芽胞を用いて特異性を調べたところ、どのクローンも調べた限りどの菌の芽胞にも結合し、種特異性は示さなかった。芽胞共通に特異的なRNAアプタマーが得られたものと結論された。この途上、RNA蛍光ラベル法を改良し、迅速な蛍光ラベル法も開発した。

Current Status of Research Progress

Reason

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] High-affinity RNA aptamers to C-reactive protein (CRP): newly developed pre-elution methods for aptamer selection (2012)
  • Author(s): Orito, N., Umekage, S., Sato, K., Kawauchi, H., Tanaka, H., Sakai, E., Tanaka, T., and Kikuchi, Y.
  • Journal Title: J. Physics Conf. Ser. Pages: 352
  • DOI: DOI:10.1088/1742-6596/352/1/012042
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] RNA aptamer(s) inhibit the growth of the fish pathogen viral hemorrhagic septicemia virus (VSHV) (2012)
  • Author(s): Punnarak, P., Santos, M. D., Hwang, S. D., Kondo, H., Hirono, I., Kikuchi, Y., and Aoki, T.
  • Journal Title: Marine Biotechnology Volume: 14 Pages: 752-761
  • DOI: DOI 10.1007/s10126-012-9448-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inhibition of hirame rhabdovirus (HIRRV) growth by RNA aptamers (2012)
  • Author(s): Hwang, S. D., Midorikawa, N., Punnarak, P., Kikuchi, Y., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T.
  • Journal Title: J. Fish Diseases Volume: 35 Pages: 927-934
  • DOI: doi:10.1111/jfd.12000
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] In vivo circular RNA expression by the permuted intron-exon (PIE) method (2012)
  • Author(s): Umekage, S., Uehara, T., Fujita, Y., Suzuki, H., and Kikuchi, Y.
  • Journal Title: in Innovations in Biotechnology (Ed. E. C. Agbo) Volume: Chapter 4 Pages: 75-90
  • DOI: ISBN 978-953-51-0096-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] non-coding RNAはじめて物語：じつは古参だったニューフェース (2012)
  • Author(s): 菊池 洋
  • Journal Title: 細胞工学 Volume: 31 Pages: 675-676
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Horizontal gene transfer mediated by gene transfer agent of marine phototrophic bacterium Rhodovulum sulfidophilum (2012)
  • Author(s): Junya Yamamoto, Hiroyuki Komatsu, Hiromichi Suzuki, So Umekage and Yo Kikuchi
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会（ワークショップへの招待講演）
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 20121211-20121214
  • Invited
• [Presentation] 機能性RNAを用いたアガロースのゾル-ゲル転移 (2012)
  • Author(s): S. Umekage and Y. Kikuchi
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会（ワークショップへの招待講演）
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 20121211-20121214
  • Invited
• [Presentation] Designed RNA-induced agarose sol-gel transition (2012)
  • Author(s): S. Umekage and Y. Kikuchi
  • Organizer: Irago Conference (AP-IRC2012)
  • Place of Presentation: 伊良湖（愛知県）
  • Year and Date: 20121115-20121116
• [Presentation] T7 RNAポリメラーゼを導入したRhodobacter capsulatusによる機能性RNAの生産 (2012)
  • Author(s): 横田哲朗、藤田能亘、鈴木宏道、長尾信義、梅影 創、菊池 洋
  • Organizer: 第14回日本RNA学会年会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 20120718-20120720
• [Patent(Industrial Property Rights)] 改良されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物 (2012)
  • Inventor(s): 梅影創、越智明徳、菊池洋
  • Industrial Property Rights Holder: 梅影創、越智明徳、菊池洋
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: PCT/JP2012/064491
  • Filing Date: 2012-05-30
  • Overseas