2010 Fiscal Year Annual Research Report
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22659237
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤堂 省 北海道大学, 大学院・医学研究科, 特任教授 (60136463)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾崎 倫孝 北海道大学, 大学院・医学研究科, 特任教授 (80256510)
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| Keywords | 光イメージング / 非侵襲的モニタリング / 動的解析 / ストレス測定 / 分子機能プローブ / 酸化的ストレス / 小胞体ストレス / Akt |
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| Research Abstract |
肝臓を中心とした臓器へのストレスを評価する方法の創出に向けた基盤研究を開始した。ストレス評価法としては、非侵襲的、経時的評価が可能な方法として、光イメージングを中心とした測定手法(光プローブ)の開発と評価に取り掛かった。とくに、蛍光系および発光系のプローブ(酸化ストレスおよびアポトーシス)を利用したストレスのリアルタイム測定の可能性を検討した。
1)種々のストレスマーカーにたいする分子機能プローブ(GFP蛋白改変によるレドックス感受性プローブ、カスパーゼ3活性に反応するルシフェラーゼ・プローブ)を作成した。
a)ルシフェラーゼを基盤とした光プローブの作成:ストレスに関連する分子、糖代謝、脂肪代謝に関連する分子、細胞の生存・増殖に関連する分子に対する活性化(分子機能)プローブを作成した。i)酸化的ストレスを示す発光プローブの作成:ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを修飾するにより発光プローブを開発した。ii)蛍光物質(GFP)を基盤とした酸化的ストレスに対するプローブの作成:GFPのchromophoreの近傍のcysteineに対する
mutantを作成することにより、レドックス感受性のプローブを作成する。
2)細胞実験:細胞ストレス実験による上記プローブの機能の特異性およびシグナル強度の検証およびベクターの検討
a)上記のプローブ作成後、肝細胞株をもちいて、transient transfectionし、細胞内に導入して、プローブの有効性を確認する。生体レベルでは、刺激によりベースラインのシグナル強度の5-10倍のシグナルを発する必要があり、細胞レベルでの検討により、必要に応じてプローブのデザインを再構築し、最適のプローブを作成した。
1)酸化的ストレス、2)低酸素、3)高血糖ストレスなどによるストレステストでプローブのin vitroでの有用性を検討し、良好な結果を得た。
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