2011 Fiscal Year Annual Research Report
造精機能障害における精巣幹細胞分化異常の可能性ー責任遺伝子の同定と機能解析ー
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22689044
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
水野 健太郎 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助教 (70448710)
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| Keywords | 精原細胞 / 幹細胞 / 停留精巣 / 細胞分化 |
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| Research Abstract |
私たちは造精機能障害をきたす疾患として停留精巣を研究対象とし、精子形成メカニズムについて基礎的・臨床的それぞれの面からアプローチしてきた。本研究では、精巣幹細胞およびその分化過程に着目し、この過程に関わる遺伝子を同定するとともに、疾患との関連性を明らかにすることを目的とした。前年度までに、ラット精巣から精巣幹細胞の分離培養を試みた。生後3～4週齢のS-Dラット精巣を摘出し、白膜を除去。培養液中で細切した後、collagenaseおよびdispase処理によって細胞を分散した。41μmメッシュを用いて均一の大きさの細胞を選別したのち、I型コラーゲンでコートした培養皿にまくことで、コラーゲンに接着する体細胞と接着しない生殖細胞とに分離することができた。浮遊細胞をラミニンコート培養皿にまき、ラミニンに接着する精巣幹細胞分画の分離を試みた。昨年度行った実験では、dispase処理のみでは均一に細胞分散できないことが明らかとなり、collagenaseが有用であることが判明した。生後3週程度の精巣6-10個を使用すると、得られる細胞数は、1×10^7個～1×10^8個であるごとが明らかとなった。
本年度では、停留精巣特異的遺伝子(EEF1A1, TRT1)の精巣位置による発現量の違いや、経時的発現について検討を行った。停留精巣は精巣下降が妨げられる先天異常であるが、治療前の精巣の位置によって、腹腔内精巣、鼠径管内精巣、遊走精巣、と分類することができる。ヒト精巣において、治療前の精巣位置とEEF1A1, TRT1遺伝子発現量とを比較・検討したところ、精巣位置が高位になるほど、これらの遺伝子発現量が高値であった。また電子顕微鏡・光学顕微鏡を用いた病理組織学的検討では、精巣位置が高位になるほど、精子形成細胞の変形が強く認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画では、精巣幹細胞の培養系を確立するとともに停留精巣からも同様の細胞培養系を確立し、細胞表面マーカーや停留精巣特異的遺伝子の変化について検討を行う予定であった。しかしながら、正常精巣由来の精巣幹細胞の培養系がいまだ不安定であり、効率のよい条件検討が必要である。また、停留精巣特異的遺伝子の同定をしたものの、経時的な発現変化や細胞局在などの発現プロファイルの検討が不十分であるため、当初の研究計画からはやや遅れていると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果では不足している点を再検討するとともに、他の研究員からの助言をもとに本年度で行うべき研究内容についてタイムスケジュールを作成して実施したい。具体的な内容では、精巣からの初代培養系において精巣幹細胞の回収量を増やすために、精巣幹細胞の特異的表面マーカーであるEpCAM、c-Kit等を1次抗体とし、磁気ビーズを利用した細胞選別法(autoMACS[○!R])を利用する。また、停留精巣からも精巣幹細胞の培養系を確立したい。停留締巣特異的遺伝子の機能解析の一部として、他因子との相互作用の解析法を予定しているが、研究を効率的に進めるために、受託解析サービスの利用も検討している。
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