生体制御システムを利用した低酸素病変部を感知するバイオセンサー型プローブの創製

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22700469
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 門之園 哲哉 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教 (10510282)
• Keywords: バイオセンサー / 腫瘍内低酸素 / 生体イメージング / 低酸素応答 / タンパク質分子設計

Research Abstract

本研究はがんや循環器系疾患で治療標的として非常に注目されている、低酸素環境を検知するプローブの創製を例として、汎用性・実現性の高い手法を組み合わせた環境検知プローブの分子設計において有効な方法論を提供することを目的とする。そこで、低酸素条件下では細胞内でシグナルを発するが、通常酸素条件下ではシグナルが消失する「バイオセンサー型プローブ」を設計する。本年度はまず、低酸素応答で中心的な役割を果たす転写因子HIFの細胞内存在量を規定しているpVHLタンパク質を鋳型とするプローブの分子設計を行うために、pVHL遺伝子を増幅し、細胞内発現用ベクターに組み込んだ。最終的には大腸菌で発現させて精製し、近赤外蛍光色素を結合させた外部投与型のプローブを目指しているが、今後作成する多くの変異型プローブタンパク質について低酸素応答性を簡便に評価するために、哺乳類培養細胞内で発現させる。また、細胞膜透過性ドメイン配列とFLAGタグ配列をpVHL配列に融合した。そこで、変異の1段階目として、近赤外蛍光色素を結合させるためのシステイン残基の位置を任意に選択できるように、pVHLに内在する2つのシステイン残基をアラニン、グリシン、セリンに置換した変異型プローブタンパク質7種をコードするベクターの構築を行った。現在、培養細胞内で発現させて低酸素応答性を調査中であり、最も感度のよい変異体を用いてさらに高機能化を進めていく予定である。