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2010 Fiscal Year Annual Research Report

新たな分子標的薬の開発:SELEX法を用いたEGFに対するRNAアプタマーの創製

Research Project

Project/Area Number 22700918
Research InstitutionHiroshima University

Principal Investigator

浜井 洋一  広島大学, 病院, 病院助教 (90423384)

Keywords核酸治療 / SELEX法 / RNAアプタマー / EGF
Research Abstract

本年度はEGFに対するRNAアプタマーの取得、アプタマーのEGFへの親和性、特異性、EGFRリン酸化阻害の検討を研究目標とし、以下のとおり実施した。
1,ビオチンタグ化EGF蛋白質の作製。
EGFタンパク質をコードするcDNAをPinPointTM Xa-1 T-Vectorのクローニングサイトに挿入。大腸菌でビオチンタグ化EGF蛋白質を発現させた。これを精製しビオチンタグ化EGF蛋白質を取得した。
2,SELEX法
N50のランダム配列をもつ合成オリゴヌクレオチドをPCRにて増幅。T7 RNA増幅法を行い、この増幅RNAをEGF蛋白と結合させる。EGFに結合したRNAのみを回収。Reverse transcriptionにて1st strand DNAを合成し、次に2nd strand DNAを合成する。これを次の選別に使用する。この一連の淘汰、選別、増幅の操作を15 round繰り返すことによって、EGFに特異的に結合するRNA(抗EGFアプタマー)を取得する。現在、この手法を行っておりRNAの回収を行っている。
今後、以下の方法によって、アプタマーの選別、EGFRリン酸化阻害の検討を行う。
3.アプタマーの選別
(1)SELEX法にて得られたRNAのシークエンスを行い、共通配列の検索を行う。
(2)ゲルシフトアッセイにて、抗EGFアプタマーとEGFとの結合を確認する。
(3)リン酸化チロシンEGFR抗体を用いたウエスタンブロット法にて、アプタマーを加えたときのEGFRのリン酸化を定量。抗EGFアプタマーとEGFの結合によるEGFRのリン酸化阻害(シグナル伝達の阻害)を確認する。
(4)ゲルシフトアッセイにてEGFと親和性が高く、EGFRリン酸化を最も阻害する抗EGFアプタマーを選別する。
EGFに結合することによって、そのシグナル伝達を阻害するRNAアプタマーを取得する。新たな分子標的薬創製につなげていきたい。

  • Research Products

    (3 results)

All 2011 2010

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (1 results)

  • [Journal Article] Successful Management of Multiple Esophagorespiratory Fistulas Using Two Types of Stent : Report of a Case2011

    • Author(s)
      浜井洋一
    • Journal Title

      Surgery today

      Volume: (in press)

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 再発形式と予後因子からみた食道癌に対する外科治療戦略2010

    • Author(s)
      檜原淳
    • Journal Title

      癌の臨床

      Volume: 56 Pages: 213-218

  • [Presentation] Results of neoadjuvant chemoradiotherapy with docetaxel and 5-FU followed by esophagectomy for locally advanced esophageal cancer2010

    • Author(s)
      浜井洋一
    • Organizer
      35th ESMO Congress
    • Place of Presentation
      イタリア ミラノ
    • Year and Date
      2010-10-09

URL: 

Published: 2012-07-19  

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