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2011 Fiscal Year Annual Research Report

生体内のタンパク質3分子間相互作用をリアルタイム検出する発光プローブ分子の開発

Research Project

Project/Area Number 22750067
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

菅野 憲  東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (60466795)

Keywords分析化学 / 生体分子
Research Abstract

生きた動物細胞内のタンパク質3分子の複合体形成をリアルタイム検出する発光プローブ分子の開発を行った.具体的には,ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ(Renilla reniformis luciferase; Rluc)を利用し,3分子のタンパク質が相互作用して初めて発光活性を回復する,キメラタンパク質プローブ分子を作製した.
作製したプローブを用い,GTP結合型タンパク質のサブユニットα,β,およびγ(それぞれGα,Gβ,およびGγ)の3量体形成の可視化検出を行った.Gタンパク質共役受容体(GPCR)のひとつであるADRA2Aを発現する細胞に,分割Rluc断片を連結したGα,Gβ,およびGγを発現させた.ADRA2AのリガンドであるUK14304で細胞を刺激したところ,Gα,Gβ,およびGγの解離に基づく発光強度の減少が観察された.
また,ALK5によりリン酸化されることで3量体を形成するSmad2およびSmad4の可視化検出を行った.不活性型ALK5(ALK5TD)もしくは常時活性型AKL5(ALK5KR)を発現する細胞に分割Rluc連結Smad2およびSmad4を発現させた.ALK5KR発現細胞から高い発光値が観察され,その値はAKL5TDの約2倍であった.
以上のことから,開発した3分割Rlucは,タンパク質の3量体形成の可視化に応用化のである.
本研究の成果は,タンパク質間相互作用の新たなスクリーニング法や化学物質の薬理活性のスクリーニング法として,生命科学の基礎研究や臨床医学,創薬などのさまざまな場面で利用されることが見込まれる.

Current Status of Research Progress
Reason

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

  • Research Products

    (4 results)

All 2012 2011

All Journal Article (1 results) Presentation (2 results) (of which Invited: 1 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Detection of Protein-Protein Interactions in Bacteria by GFP-Fragment Reconstitution2011

    • Author(s)
      A. Kanno, T. Ozawa, Y. Umezawa
    • Journal Title

      Methods Mol. Biol.

      Volume: 705 Pages: 251-258

  • [Presentation] Genetically Encoded Split Protein Fragments to Illuminate Biological Functions in Living Subjects2012

    • Author(s)
      A. Kanno
    • Organizer
      5th International Symposium on Nanomedicine
    • Place of Presentation
      名古屋大学東山キャンパスESホール(愛知県)
    • Year and Date
      20120317-20120317
    • Invited
  • [Presentation] Genetically Encoded Bioluminescent Indicators for Real-Time Dual Imaging of Protease Activities in Living Cells2011

    • Author(s)
      A. Kanno
    • Organizer
      IUPAC International Congress on Analytical Sciences 2011 (ICAS2011)
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都府)
    • Year and Date
      20110518-20110518
  • [Book] 改訂六版 分析化学便覧,日本分析化学会編2012

    • Author(s)
      菅野憲
    • Total Pages
      880
    • Publisher
      丸善

URL: 

Published: 2014-07-24  

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