2010 Fiscal Year Annual Research Report
電気化学高速原子間力顕微鏡を用いたP型ATPaseの一分子反応解析
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22770148
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
横川 雅俊 筑波大学, 数理物質系, 助教 (50447885)
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| Keywords | 高速原子間力顕微鏡 / P型ATPase / 筋小胞体カルシウムポンプ / ナトリウムポンプ / 一分子反応解析 / 電気生理 |
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| Research Abstract |
イオンポンプは,生体膜を隔ててイオンを輸送する膜タンパク質の一種であり,ATPを加水分解して得られる化学エネルギーを用い,濃度勾配に逆らってイオンを能動輸送する.近年,形質膜中でカチオン輸送を行うP型ATPaseの中の一つである筋小胞体カルシウムポンプ(SERCA)の解析が進み,ダイナミックな構造変化を伴うイオン輸送の実体が明らかにされつつある.その一方で,SERCA以外のP型ATPase分子に関しては研究が遅れている.本研究課題では,「液中高速原子間力顕微鏡によるリアルタイム・ナノ構造解析技術」と「電気生理学的実験手法」とを組み合わせ,生体膜中にあるSERCAおよび細胞膜ナトリウムポンプの反応を,構造的・機能的側面から1分子レベルで解析し,ATPの化学エネルギーを利用したイオン輸送機構の分子レベルでの理解を目指した.
(1)マイカ基板上にイオンポンプを含んだ膜試料を滴下し,高速原子間力顕微鏡用試料とする実験手法を確立した.
(2)上記基板上に用意した,SERCAおよびNa^+_-Pump試料の高速原子間力顕微鏡観察を行い,静止状態における両試料の形態解析を行った.その結果,Na^+_-Pmmp試料においては,SERCAとほぼ同じ大きさをもつ構造と,SERCAに比べ半分以下の高さしかない構造が存在していることが確認された.
(3)高速AFM装置と電気化学測定装置とを組み合わせることを目的に,まず電気化学測定装置のセットアップを行った.
(4)ATP存在下,生理的条件下におけるSERCAの反応観察を行い,5ミリ秒の時間分解能でその構造変化を観察することに成功した.
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