分子生物学的方法を用いた腸内細菌科菌群の迅速定量法と同定システムの構築

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22780191
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 高橋 肇 東京海洋大学, 海洋科学部, 助教 (40413116)
• Keywords: 食品微生物 / 遺伝子 / 腸内細菌科菌群

Research Abstract

近年、食品の衛生指標とする菌群の検査は、これまで日本で行われてきた衛生指標菌検査である「大腸菌群」ではなく、国際的に「腸内細菌科菌群」を指標とした検査に移行してきている。しかし、腸内細菌科菌群の迅速で簡便な検出・定量法およびその同定法は確立されていない。本研究では、分子生物学的手法を用い、腸内細菌科菌群の菌数を数時間で検出・定量できる手法を構築し、あわせてDNA多型解析法による簡易同定法を確立することを目的とし、研究を遂行した。
まず、腸内細菌科菌群(Enterobacteriaceae)検出法の構築に取り組んだ。腸内細菌科菌群は、多様な菌種を含む菌群であり、同菌群すべてに特異的に存在する遺伝子はこれまで見つかっていない。本研究では、腸内細菌科菌群以外にも普遍的に存在するハウスキーピング遺伝子から、腸内細菌科菌群特有の配列を選抜し、その配列を基にプライマーを設計、その後、包括的および排他的に優れたPCR反応系の構築を行い、評価を行った。
具体的には、腸内細菌科菌群および非腸内細菌科菌群に共通する様々な遺伝子のアライメントを取り、検出に適した遺伝子の検討を行った。その結果、rplP遺伝子(ribosomal protein L16)領域に設計したPCRプライマーセットで腸内細菌科菌群のみの検出に成功した。また、各社より発売されている遺伝子増幅試薬についてもPCR増幅条件を検討し、それぞれ腸内細菌科菌群のみを正確に検出することが出来る条件の検討も行った。
次年度以降はこの検出法を基に、ISO法に定められた培養法と比較し、実際に食品においても用いることができるかどうか検討を行い、先に述べた腸内細菌科菌群の検出・定量法および同定法の構築を行う予定である。