2011 Fiscal Year Annual Research Report
新奇ヒ素トランスポーターの単離に向けた究極の酵母タンパク質発現ライブラリーの構築
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22780291
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
秋廣 高志 島根大学, 生物資源科学部, 助教 (40508941)
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| Keywords | ヒ素 / トランスポーター / 酵母ライブラリー / アクアポリン / Genetic screening / ICP-MS / 膜タンパク質 |
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| Research Abstract |
イネ完全長cDNAプロジェクトにより約3万5000個の遺伝子が単離されている。そのうち、トランスポーターであると機能類推されているのは約1500遺伝子である。これらをイネゲノムリソースセンターから入手し、遺伝子部分のみをPCRにて増幅した後、酵母タンパク質発現ベクター(pYES2)にGAP-repair cloning法を用いてサブクローニングした。シークエンスによって遺伝子が正しく挿入されていることを確認したのち、W3031AΔacr1株に形質転換し、ライブラリーを構築した。ライブラリーを3価又は5価のヒ素を含む培地で培養し、ヒ素に感受性を示す酵母を選抜した。擬陽性を無くすために4度のスクリーニングを行い、最終的に3価のヒ素で8クローン、5価のヒ素で9クローンを単離することに成功した。3価と5価のどちらのヒ素にも感受性を示すクローンも1つ単離された。単離されたクローンの機能類推を行う目的でBLASTPサーチを行った。その結果、得られたクローンの多くは機能未知のタンパク質であることが明らかとなった。機能が推定された二つのタンパク質はどちらもアクアポリンであった。つづいて、単離したクローンのヒ素輸送活性を明らかにする目的で、酵母中のヒ素含量をICP-MSを用いて定量した。その結果、すべてのクローンでベクターコントロールよりも高い輸送活性が認められた。これらの結果から今回構築したスクリーニング系が予想通り機能することが証明された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ライブラリーの構築が予想よりも早く終了した結果、スクリーニングも本年度内に終了することができた。すでに来年度の計画に着手しており、計画通りに研究が進展するものと予想している。
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| Strategy for Future Research Activity |
単離したクローンの植物体内での機能解明を行う。RNAiや過剰発現体を作成し形質転換体の評価を行う予定である。
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[Journal Article] Rice ABCG43 is Cd inducible and confers Cd tolerance to yeast2011
Author(s)
Oda,K., Otani,M., Uraguchi,S., Akihiro, T., Fujiwara,T.
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Journal Title
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
Volume: 75
Pages: 1211-1213
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