2012 Fiscal Year Annual Research Report
新奇ヒ素トランスポーターの単離に向けた究極の酵母タンパク質発現ライブラリーの構築
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22780291
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
秋廣 高志 島根大学, 生物資源科学部, 助教 (40508941)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | ヒ素 / トランスポーター / 膜輸送体 / 酵母ライブラリー |
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| Research Abstract |
イネには約4万個の遺伝子が存在すると推測されている。そのうち約1500個が輸送体（トランスポーター）をコードする遺伝子であると予想されている。本研究は、これらの輸送体遺伝子を全て発現する酵母タンパク質発現ライブラリーを構築し、このライブラリーを用いてヒ素の輸送体を単離することを目的に研究を行った。
まず、イネゲノムリソースセンターから約1500個の輸送体遺伝子を分譲していただいた。これらの遺伝子は大腸菌の発現ベクターに挿入されていたことから、遺伝子部分のみをPCRにて増幅し、これをGAP repair cloning法を用いて酵母タンパク質発現用ベクター（pYES2）にサブクローニングした。こうして得られたプラスミドを全てシーケンスし、目的の遺伝子が正しくベクターに挿入されていることを確認した。確認のできたプラスミドを、ヒ素に感受性を示す酵母に形質転換し、これを96穴フォーマットでグリセロールストックした。続いて、これらのライブラリーを3μMもしくは10μMの3価のヒ素または5価のヒ素を含む固形培地にて培養し、ヒ素に対して感受性を示す酵母を選抜した。3価のヒ素では8株、5価のヒ素では10株が感受性を示した。同様の結果が液体培地を用いた実験でも観察された。これらの酵母が培地中のヒ素を過剰に吸収したことを確かめる目的で、これらの酵母をヒ素を含む液体培地で1時間培養した後培養を止め、細胞内のヒ素を抽出し、ICP-MSを用いてヒ素含量を定量した。その結果、単離した全ての酵母がベクターのみを導入した酵母よりも高いヒ素含有量であることが明らかとなり、導入した輸送体にヒ素輸送活性があることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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