円石藻の形質転換系の確立とココリス形成関連遺伝子の単離

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22780294
• Research Institution: Toyo University
• Principal Investigator: 長坂 征治 東洋大学, 生命科学部, 准教授 (60534013)
• Keywords: バイオテクノロジー / 生体機能利用 / バイオミネラル / 円石藻 / 遺伝子

Research Abstract

海洋性の単細胞藻類である円石藻、細胞表面にある炭酸カルシウムを主成分とした円石(ココリス)形成の分子機構を解明するために,基盤技術となる形質転換系の確立を目的として研究を行った。野生型株を用いて生育速度を指標に形質転換時のマーカーとして用いる抗生物質のスクリーニングを行った。カナマイシン,クロラムフェにコールなど数種の試薬について濃度を変えて添加し生育を測定した結果,ブレオマイシン系の薬剤であるゼオシンに対して円石藻が感受性を示したことから,形質転換に用いるベクターとして円石藻のアクチン遺伝子のプロモーター領域の下流にブレオマイシン耐性遺伝子を導入したベクターを作成した。形質転換を行う前に,ベクターを細胞内へと導入する条件についても検討を行った。株の異なる円石藻のプロトプラスト作成条件を参考にして,塩化カリウム溶液に細胞を浸漬し細胞のプロトプラスト化を行った。溶液の濃度,浸漬時間,回収法について検討を行い現時点での最適化を図った。ベクターの代替として蛍光標識デキストランを用いて作製したプロトプラストへのベクター導入の条件を検討した。その結果,エレクトロポレーション法により導入を行った細胞内でデキストラン由来の蛍光が観察された。細胞濃度,装置条件等を変えて導入を行い,約30%程度の細胞に強い蛍光が観察される条件を決定した。この条件下でマーカー遺伝子,レポーター遺伝子としてGFP遺伝子を導入したベクターの円石藻細胞への導入を試みたが,顕著なゼオシン耐性やGFPタンパク質の蛍光は観察されず形質転換系の確立にはいたっていない。細胞内へのベクターの導入は確認できたことから,タンパク質の発現,安定性等に問題があるものと考えられる。ベクターの導入に必要な細胞の調整,導入条件等を決定したことから,今後は,ベクターに組み込む遺伝子の改変等を中心に研究を進める。