| Research Abstract |
本年度は,昨年度明らかにした抗結核薬D-サイクロセリン(DCS)の生合成に必須な遺伝子を大腸菌で発現させ,大腸菌を宿主としたDCS生産系の構築を行った。また,DCS生合成遺伝子の一部を利用し,放線菌Streptomyces(S.)lividansを宿主とした,L-アルギニンから抗癌剤であるヒドロキシ尿素(HU)への微生物変換系の開発を試みた。
まず,DCS生合成に必須のdcsC, dcsD, dcsE,およびdcsG遺伝子をPCRで増幅後,それぞれを発現ベクターpET-21a(+)に挿入し,構築したベクターを大腸菌に導入した。各遺伝子産物の大腸菌における発現性をSDS-PAGEにて調べたところ,全遺伝子産物が可溶性タンパク質として発現することが明らかになった。そこで,4つの遺伝子をXbaI-SpeIカセット法によりタンデムに連結し,発現ベクターpET-21a(+)に挿入後,構築したベクターを大腸菌に導入した。基質であるL-セリンとHUの存在下,得られた大腸菌を培養し,DCSの生産をHPLCにより調べた結果,DCSが生産されていることが明らかになった。この成果は,DCSを大腸菌で生産させた最初のものである。しかしながら,その生産性は生産菌であるS.lavendulaeに比べて低かった。その原因を究明した結果,4つの遺伝子産物のうち,DcsGの発現が低くなっているためであることが明らかになった。今後,DcsGの発現を改善する必要がある。
一方,DCS生合成遺伝子のうち,dcsAおよびdcsBを利用し,S.lividansを宿主としたL-アルギニンからHUへの微生物変換系の構築については,現在,dcsA遺伝子の導入まで完了したところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在まで,遺伝子破壊実験によるD-サイクロセリン(DCS)生合成に必須な遺伝子の同定は完了した。また,DCSの大腸菌における異種生産については,当初予定したとおり,達成することができた。一方,DCS生合成遺伝子を利用した抗癌剤ヒドロキシ尿素の微生物変換系の構築については,ひとつの遺伝子を導入するところまで達成することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで,ほぼ予定通りに研究成果が得られているため,今後の推進方策について大きな変更はない。ただし,大腸菌における抗結核薬の異種生産については,現在のところ生産性が低いので,宿主大腸菌のアミノ酸代謝経路を遮断することにより,DCS生産性の更なる向上を目指す研究を来年度追加する。また,DCS生合成遺伝子を利用した抗癌剤ヒドロキシ尿素の微生物変換系の構築については,本年度,完全に達成することができなかったため,来年度,早急に完了させる。
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