2010 Fiscal Year Annual Research Report
高LDL血症におけるマクロファージの泡沫化とプラスミン活性の役割
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22790247
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
岩城 孝行 浜松医科大学, 医学部, 助教 (70509463)
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| Keywords | Plasminogen / Scavenger / OxLDL / Atherosclerosis |
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| Research Abstract |
平成22年度の実施状況
1.各種スカベンジャーレセプター(SR)を導入したLLC細胞をC57Bl/6マウスの皮下に接種、免疫した。SRはマウスに対しては自己抗原であるため通常の方法では抗体を入手することができないので、接種4週間後に脾臓を摘出し、B細胞を分離し、RT-PCRにて全クラスの免疫グロブリンの可変部位を増幅した後、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖が直列に並んだ単鎖可変領域フラグメント(single-chain variable fragment : scFv)となるようにPCRにて再増幅し、リボソームディスプレイ法にてscFvを提示させ、対応するSRと反応するものを分離し、大腸菌発現系にて精製した。
2.LLC細胞に導入したSRをショウジョウバエから分離されたS2細胞にも同様に導入し、恒常的に発現する細胞群をFACSを用いて分離選択した。発現の確認はSRのアミノ末端もしくはカルボキシル末端に融合したEGFPの蛍光強度の確認を行うことで、FACSによる分離選択時に行うとともに、S2細胞の細胞膜から膜タンパクを抽出し、EGFPに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法により最終確認した。
3.#2にて分離精製したS2細胞とOxLDLとの結合実験を行うための準備及び、#1にて分離精製した抗SR-scFv群を各種SRを発現したS2細胞に添加することでOxLDLの結合および取り込み阻害を確認するための準備が整った。
4.特に#3は平成23年度以降の実験において重要な役割を示すため、OxLDLの添加量と抗SR-scFv群の添加量を慎重に検討しており、平成23年度においても引き続き検討している段階である。
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