2010 Fiscal Year Annual Research Report
頭頸部癌細胞におけるマイクロRNA活性化機序の解明
| Project/Area Number |
22791561
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
加納 里志 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教 (00374421)
|
|---|
| Keywords | 頭頸部癌 / マイクロRNA / TRIM32 |
|---|
| Research Abstract |
頭頸部癌細胞を用いて,TRIM32に特異的に結合するマイクロRNAを網羅的に同定し,そのマイクロRNAがTRIM32によって活性化されているかを解析し,また,同定されたマイクロRNAのターゲット遺伝子を同定して,それらマイクロRNAとターゲット遺伝子が実際の臨床検体ではどのように発現し,さらに,その臨床データと相関するかを検討することを目的に,今年度は下記の研究を行った.
1.頭頸部癌細胞のcell lysateを用いて,TRIM32およびArgonaute-1に対する抗体を用いて免疫沈降実験を行い,結合するマイクロRNAを専用キットを用いて分離精製した.
2.マイクロRNA用の逆転写プライマーセットを用いてリアルタイムPCR法により網羅的にマイクロRNAアッセイを施行.
3.Argonaute-1に結合するマイクロRNAとTRIM32に結合するマイクロRNAの発現を比較し,TRIM32に特異的に結合するマイクロRNAを同定.
4.同定されたマイクロRNAのTRIM32による活性化を,ルシフェラーゼアッセイを用いて検討.
5.TARGETSCANやmiRBaseなどWeb上で利用可能なデータベースを用いて,同定されたマイクロRNAのターゲットを予測.
6.TRIM32過剰発現細胞,TRIM32ノックダウン細胞,さらにシスプラチン耐性頭頸部癌細胞における,予測されたターゲットのmRNA発現およびタンパク質発現を,リアルタイムPCR法およびウェスタンブロット法にて検討.
|
