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2023 Fiscal Year Annual Research Report

Bio- and digital technologies for the enzyme development and application for pharmaceutical synthesis

Research Project

Project/Area Number 22H00361
Research InstitutionToyama Prefectural University

Principal Investigator

浅野 泰久  富山県立大学, 工学部, 名誉教授 (00222589)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 山口 拓也  富山県立大学, 工学部, 助教 (00748527)
榊原 一紀  富山県立大学, 工学部, 教授 (30388110)
中村 正樹  富山県立大学, 工学部, 教授 (40345658)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords酵素 / デジタル技術 / 人工知能 / 医薬品合成 / 可溶性変異
Outline of Annual Research Achievements

課題1:酵素探索および最適化へのデジタル技術の導入
(1) Ogataea polymorpha 由来のカルボニル還元酵素OpCRD-Aにより、1,1,1-トリフルオロアセトン(TFA)を基質として、良好な鏡像体過剰率(>99% ee)で(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール(TFIPL)を合成できる。酵素の生産性に課題があったので、我々が開発したHydropathy contradiction ruleを用いて、可溶性発現量を増加させる変異体V136Fを獲得した。可溶性タンパク量の比活性の向上により、単位培養液当たりの酵素活性が向上した。
(2) KEGGおよびBRENDAなどの酵素データベースを用い、有機合成に用いる化学反応に対して最適な酵素候補をEC番号として予測するモデルの作成を行った。基質2種類,生成物2種類からなるEC 3に属する酵素反応に対し、subclass(2桁目)およびsub-subclass(3桁目)を予測するモデルを開発した。BRENDAなどの文献反応12種に対して十分な予測精度が得られた。
課題2:医薬品中間体などの有用物質製造プロセスへの実装
(1)ヤスデ Oxidus gracillis 由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(OgraHNL)は、医薬品の重要な中間体である(R)-2-クロロマンデロニトリル((R)-2-Cl-Man)の合成に対して優れた比活性とエナンチオ選択性を示した。OgraHNLと様々な基質との複合体の結晶構造を基にして、さらに最適化するためにタンパク質工学研究を行った。アルドキシム脱水酵素Oxdを用いてジヒドロイソオキサゾールを基質とし、光学活性なβ-ヒドロキシニトリル(99 % ee)を単離収率45 %で合成し、糖尿病薬をターゲットとする合成法を探索した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

(1)可溶性発現 Ogataea polymorpha 由来のカルボニル還元酵素OpCRD-Aは(S)-1,1,1-トリフルオロ-2-プロパノール(TFIPL)を優れた鏡像体過剰率(>99% ee)で合成できるが、発現量などの課題があった。我々が開発したHydropathy contradiction ruleを用いて、可溶性発現量を増加させる変異体V136Fを獲得した。多数の変異型酵素をスクリーニングすることなく、単位培養当たり発現量が向上した変異体を得ることができた。
(2)有機合成において、酵素反応の導入法が課題である。公開されている酵素データベースを用い、有機合成に用いるリパーゼの探索において、十分な予測精度が得られた。
(3)Bacillus 由来Oxdが触媒するKemp脱離反応は新規な酵素的光学分割法である。本反応を用いて4,5-ジヒドロイソキサゾールのNO結合をエナンチオ選択的に開環させ、光学活性なβ-ヒドロキシニトリルの合成を達成し、医薬品合成のルートを探索し、達成できる目途が立った。
このように、着実に本研究の課題を達成している。

Strategy for Future Research Activity

課題1:酵素探索および最適化へのデジタル技術の導入
(1) 医薬中間体であるフッ素含有光学活性アルコールの酵素的合成を高収率、高立体選択的に行うために、新しいカルボニル還元酵素をin silicoスクリーニングで得る。それらのフッ素含有光学活性アルコールへの有効利用を行う。(2) 人工知能等のデジタル技術の活用 大腸菌の全てのタンパク質を再構成型無細胞タンパク質合成系にて合成させた際の凝集の度合い(可溶性率)と合成量の実験結果を網羅したデータベース(eSOL)を基に機械学習機(人工知能)の構築を行う。
課題2:医薬品中間体などの有用物質製造プロセスへの実装
(1)スーパー酵素ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(HNL)の医薬品合成への利用 in silicoデザインすることで高機能化したヤスデ由来HNLを用いて、光学活性マンデル酸類を高収率、高不斉収率で得る。合成した(R)-2-クロロマンデロニトリルなどを原料にした医薬品原薬の合成プロセスの開発を行う。また、高比活性であるヤスデ由来HNLのX線構造解析の結果に基づく改変を行い、ニトロメタンを求核剤として用いるHenry反応に利用する。(2) アルドキシム脱水酵素(Oxd)のKemp脱離反応の光学活性体合成への利用 Oxdにより合成した光学活性なβ-ヒドロキシニトリル類を用いて、目的とする医薬品を合成する。

  • Research Products

    (14 results)

All 2024 2023 Other

All Journal Article (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results) Presentation (10 results) (of which Int'l Joint Research: 7 results,  Invited: 3 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Nitrile-synthesizing enzymes and biocatalytic synthesis of volatile nitrile compounds: A review2024

    • Author(s)
      T. Yamaguchi、Y. Asano
    • Journal Title

      J. Biotechnol.

      Volume: 384 Pages: 20-28

    • DOI

      10.1016/j.jbiotec.2024.02.007

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structure-Based Site-Directed Mutagenesis of Hydroxynitrile Lyase from Cyanogenic Millipede, Oxidus gracilis for hydrocyanation and Henry reactions2024

    • Author(s)
      S. Chaikaew、Y. Watanabe、D. J. Zheng、F. Motojima、T. Yamaguchi、Y. Asano
    • Journal Title

      ChemBioChem

      Volume: - Pages: e202400118

    • DOI

      10.1002/cbic.202400118

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] 化学反応に最適な酵素を予測するための機械学習を用いたEC番号予測モデルの開発2024

    • Author(s)
      武藤 克弥、岩﨑 源司、浅野 泰久、奥原 浩之
    • Journal Title

      生物工学会誌

      Volume: 102 Pages: 169-175

    • DOI

      10.34565/seibutsukogaku.102.4_169

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Discovery of Aldoxime-Nitrile Pathway, nitrile hydrate and other enzymes2024

    • Author(s)
      Y. Asano
    • Organizer
      1st UniCat Joint Symposium
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 異種発現系における封入体形成に対するアミノ酸の性質を基にした変異導入の効果2024

    • Author(s)
      篠田 優、浅野 泰久
    • Organizer
      日本農芸化学会2024年度大会
  • [Presentation] Two new thermostable carbonyl reductases from thermophilic fungi for the synthesis of fluorine containing compound2023

    • Author(s)
      Kunwadee Palasin, Surugu Shinoda, Shinsuke Miki, Yasuhisa Asano
    • Organizer
      日本農芸化学会2023年度大会
  • [Presentation] 変異型ブタ腎臓由来D-アミノ酸オキシダーゼの反応機構に基づく対称型および非対称型イミン類の合成2023

    • Author(s)
      Wiyada Khaghachit、白井聖也、岩崎源司、浅野泰久
    • Organizer
      D-アミノ酸学会
  • [Presentation] Rational design of soluble 2-oxoglutarate-dependent L-pipecolic acid hydroxylase using the α-helix rule and the hydropathy contradiction rule2023

    • Author(s)
      Suguru Shinoda, Aoi Itakura, Haruka Sasano, Ryoma Miyake, Hiroshi Kawabata, and Yasuhisa Asano
    • Organizer
      3rd Japan-Switzerland-Germany Workshop on Biocatalysis and Bioprocess Development
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Improvement of soluble expression of carbonyl reductase (OpCRD-A) from Ogataea polymorpha by rational mutagenesis2023

    • Author(s)
      Sora Ikeda, Kunwadee Palasin, Shinsuke Miki, and Yasuhisa Asano
    • Organizer
      3rd Japan-Switzerland-Germany Workshop on Biocatalysis and Bioprocess Development
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Study on the enzymatic synthesis of chiral trifluorolactic acid by lactate dehydrogenase2023

    • Author(s)
      Jingfei Wu, Aem Nuylert, Misako Iwaki, Shinsuke Miki, and Yasuhisa Asano
    • Organizer
      3rd Japan-Switzerland-Germany Workshop on Biocatalysis and Bioprocess Development
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Mechanism-based imine synthesis by engineered D-amino acid oxidase from porcine kidney2023

    • Author(s)
      Wiyada Khaghachit, S. Shirai, G. Iwasaki, and Y. Asano
    • Organizer
      3rd Japan-Switzerland-Germany Workshop on Biocatalysis and Bioprocess Development
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Soluble expression of genes for enzymes in Escherichia coli2023

    • Author(s)
      Y. Asano
    • Organizer
      Enzyme Engineering XXVII
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Development of enzymes for bioproduction1 -From screening to digital methods-2023

    • Author(s)
      Y. Asano
    • Organizer
      Thai Society of Biotechnology
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Remarks] Recent Publications

    • URL

      https://www.pu-toyama.ac.jp/BR/asano/publication.html

URL: 

Published: 2024-12-25  

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