2022 Fiscal Year Annual Research Report

Genome protection and repair mechanisms for the extreme desiccation tolerance, anhydrobiosis

Research Project

Project/Area Number	22H00372
Research Institution	National Agriculture and Food Research Organization
Principal Investigator	黄川田隆洋国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主席研究員 (60414900)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	舟橋啓慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (70324548)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Keywords	DNA修復 / 極限乾燥耐性 / ゲノム / CRISPR
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、ネムリユスリカの乾燥・再水和の過程で生じる”DNAの障害”が、”どの場所”で生じて、”どのような因子で保護・修復”しているのかを知ることで、"乾燥耐性をもたらすDNA保護・修復機構"の全容を解明することにある。これまでの研究から、Pv11細胞の極限乾燥耐性には、ゲノムDNAの高次構造を安定保護させる機構と、DNA鎖の傷害を完全に修復させる機構の双方が存在していることが示唆された。極限的乾燥耐性は、Pv11細胞以外の培養細胞では認められない事から、特殊なゲノム構造保護因子やDNA修復因子の存在が予想される。そこで本研究では、新規なゲノムDNAの保護・修復因子の同定と機能解析を行う。 2022年度はネムリユスリカに最適化された網羅的DNA二本鎖切断（DSB）マッピング法 (Pv-BLISS)の開発と、ネムリユスリカ培養細胞を用いた乾燥処理DSBデータベース（Breakome）の構築を目指した。Pv11細胞の乾燥・再水和過程の複数のタイムポイントで、細胞を固定し、コメットアッセイによりDNA障害の評価を行った。ポジティブコントロールとして実施した過酸化水素処理でPv11細胞のDNAが確かに障害を受けていることが確認できた。現在、集積したコメットアッセイのデータの画像解析を進めている。また、網羅的DSBマッピング法としてBLISSの改良版であるsBLISSをベースに手法のPv11細胞に最適化されたライブラリ構築プロトコルの開発を行い、最終的に目的とするNGS解析用ライブラリを取得した。2023年度はライブラリのシーケンスを行い、Pv11細胞の乾燥再水和過程のBreakomeデータベース構築を行う予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2022年度はネムリユスリカに最適化された網羅的DNA二本鎖切断（DSB）マッピング法 (Pv-BLISS)の開発と、ネムリユスリカ培養細胞を用いた乾燥処理DSBデータベース（Breakome）の構築を目指した。Pv11細胞の乾燥・再水和過程の複数のタイムポイントで、細胞を固定し、コメットアッセイによりDNA障害の評価を行った。ポジティブコントロールとして実施した過酸化水素処理でPv11細胞のDNAが確かに障害を受けていることが確認できた。現在、集積したコメットアッセイのデータの画像解析を進めている。また、網羅的DSBマッピング法としてBLISSの改良版であるsBLISSをベースに手法のPv11細胞に最適化されたライブラリ構築プロトコルの開発を行い、最終的に目的とするNGS解析用ライブラリを取得した。Pv11細胞は非モデル生物に由来する培養細胞であるため、既存の実験手法の改良を行ってから本実験に進む必要がある。すなわち、マウスやショウジョウバエを用いた場合のような理想的な計画進捗通りには進まないことが容易に想定できる。したがって、Pv-BLISSライブラリ構築プロトコール確立に多少の時間が取られてしまったが、ほぼ順調な進捗であると考えている。
Strategy for Future Research Activity	2023年度はBreakomeデータベース構築のために、Pv-BLISSライブラリーのシーケンスデータをネムリユスリカゲノムデータベースと照合することで、Breakome解析を行う。また、DNA保護・修復因子の候補遺伝子の選抜のためのKOスクリーニング系の構築にも着手する。