2022 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of unique biological reactions to carbon nanoparticles and world's first clinical application and safety assessment of an innovative biomaterials
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22H00582
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
齋藤 直人 信州大学, 学術研究院保健学系, 教授 (80283258)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
植村 健 信州大学, 学術研究院総合人間科学系, 教授 (00372368)
西村 直之 信州大学, 先鋭領域融合研究群バイオメディカル研究所, 教授(特定雇用) (10644940)
羽二生 久夫 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (30252050)
青木 薫 信州大学, 学術研究院保健学系, 准教授 (30467170)
中村 真紀 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 主任研究員 (00568925)
湯田坂 雅子 名城大学, 理工学研究科, 特任教授 (70159226)
塚原 完 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (00529943)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| Keywords | カーボンナノ粒子 / 生体反応 / 生体材料 / 生体安全性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カーボンナノ粒子（CNP）の医療応用に必要である独特な生体反応を解明することを目的とした１２項目にわたる課題を各担当者が行った。
微視的研究として①micro electro mechanical system技術を用いてシリコンウェハよりピンセットを製作する技術は、数μmの粒子までしか使用できなかった。②CNPの受容体の検証を複数の細胞を使って行い、MARCOだけではなかった。③カーボンナノホーン（CNH）にリン酸カルシウム（CaP）を介して破骨細胞抑制薬（BP）を担持させたCNH複合体について検討を行い、BPの種類によってCNH複合体の細胞生存率抑制効果が異なった。④マクロファージ様細胞で観察できた細胞外小胞化されたCNHは、骨芽様細胞においても電子顕微鏡により観察された。
巨視的研究として⑤摘出リンパ管灌流システムにハイスピードカメラと流体解析ソフトを導入したリンパ管腔内を流れるナノ粒子の動きについて検討を行った。⑥CNHの体内動態と比較可能な新規体内動態評価用ナノマテリアルの作製に着手した。⑦CNH内包化細胞外小胞の回収方法を骨芽細胞を使ってポリマー法で検討した。⑧遺伝子改変発癌性マウスであるrasH2 マウスの皮下組織にCNPを埋め込んだ結果を検討した。
実用化研究として⑨癌骨転移モデルでの骨組織評価として、ラットの脛骨に癌細胞を注入・定着後CNH複合体を注入した動物実験の評価を行った。⑩血液脳関門（BBB）の透過性を評価するためのin vitroモデルを構築し、神経機能性脂質であるリゾリン脂質の評価をスタートさせた。⑪経鼻経路によるCNPの脳内移行をマウスで評価し、嗅球近辺にCNPの付着が確認された。⑫骨組織を構成する骨芽細胞と破骨細胞におけるCNH単独の生体応答性評価を行い、in vitroでは深刻な細胞毒性はみられず、in vivoでは骨再生促進効果が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CNPを医療応用するために明らかにしなければいけない12項目の生体反応を大きく3つのカテゴリーに分けて研究を行っており、それぞれの項目で研究は進捗している。医療応用を目指す上でポジティブと思われる成果が1年目から出ているのは、微視的研究では③のCNPの複合体とマクロファージの反応で得られた知見であり、その成果をBiomaterials Science誌に発表などしている。巨視的研究では初年度という事でサンプル作製の検討段階だったり、動物への暴露という事で明確なポジティブな結果はないものの順調に研究が行われている。実用化研究としては⑫でCNH自体の骨形成促進作用が動物実験レベルで明らかとなり、これらの知見をNanomaterials誌に発表などをしている。これらの項目は計画以上に研究が進んでいると判断している。
その一方で、⑫のセルライン化された骨芽細胞を用いた実験で石灰化能や細胞分化能の生理機能評価実験でしばしば再現性が得られないという問題が起きた。その一つの原因として、我々は用いる細胞培養液が原因であることをすでに発表したが、今回のCNH単独のための生理機能評価においても再現性が得られないことがあった。この問題は広くこのセルラインを利用している研究者には知られている問題であるが、より複雑なCNH複合体の骨形成機能を正確に評価するためにその評価条件を優先して確立する必要があると考えた。このため、先入観が入る可能性があるCNH複合体の動物実験のため予算執行を次年度に延期することとなった。この点で全体としての進捗区分は「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
3つのカテゴリーに分けた12項目の研究テーマをそれぞれ継続して行っていくが、①ピンセット方式でのナノマテリアルのone-on-one法は難しいことから別のアプローチを検討する。まずは1つのナノ粒子と1細胞の反応を見る系の構築を目的としてCNPよりも安価に自作でき、物理化学的に1粒子をコントロールし易く、検出もし易い強磁性体であるナノフェライト粒子（NFP）をCNPと並行して研究対象とすることにする。さらに別の方法としてピペット法が可能であるかを検討する予定である。②CNPの取り込みに関与する骨芽細胞でのレセプターを同定する。③BPと実質的に結合するCaPについての条件をより詳細に検討する。④骨芽細胞で見られたCNP含有細胞外小胞の回収を試みる。⑤リンパ管内を移動するCNPの粒子画像流速の検討を行う。⑥①で検討する強磁性体であるNFPの物性評価と体内動態観察に利用できるかを検討する。⑦CNHを内包化した骨芽細胞の細胞外小胞はポリマー法での回収はあまりうまくいっていないように感じている。この原因を明らかにした上で対策を検討する。⑧皮下組織にCNPを暴露したrasH2 マウスの評価を行う。⑨癌骨転移モデルラットを使ったCNH複合体の組織評価を行う。⑩リゾリン脂質単独でのBBBの透過性を評価する。⑪ナノマテリアルの脳内移行の機序として考えられる嗅神経経由を検討するため、嗅神経細胞を購入し、CNPとの関係を調べる。⑫CNH複合体の骨関連細胞・組織の反応としては優先して破骨細胞での評価を行う。並行して骨芽細胞での骨形成能評価で再現性が得られる測定条件の検討を行う。再現性が得られる条件ができ次第、骨芽細胞を使った評価も行い、動物実験もスタートする。
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