2022 Fiscal Year Annual Research Report
Understanding a mechanism of an onset of colorectal cancer by colibactin and finding compounds inhibiting colibactin biosynthetic enzymes
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22H04979
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
渡辺 賢二 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (50360938)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
椙村 春彦 浜松医科大学, 医学部, 教授 (00196742)
武藤 倫弘 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30392335)
國澤 純 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 ワクチン・アジュバント研究センター, センター長 (80376615)
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| Project Period (FY) |
2022-04-27 – 2027-03-31
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| Keywords | コリバクチン / 大腸菌 / 天然物 / 生合成 / 大腸がん / 遺伝毒性物質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は大腸がん患者数を減少させることにある。その目的を達成するための方法として、腸内細菌由来大腸がん原因物質コリバクチンが大腸がんを誘起するメカニズムの解明とコリバクチン生産抑制法の考案に取り組んだ。本年度は特にコリバクチンの高感度検出法の確立のためのコリバクチン産生菌に対する抗体の探索について報告する。
コリバクチン産生菌に対する抗体の探索
コリバクチン産生菌感染の高感度検出法の確立のため、コリバクチン産生菌に特異的なモノクローナル抗体の取得を目指した。まずは我々がヒトの大腸がん組織検体より分離、培養に成功し、既報のコリバクチン産生菌と比較して約30倍もの高産生量を示したコリバクチン産生菌株（E. coli-50と命名、以下#50と表記）に対するモノクローナル抗体を作製した。得られた抗体を用いてスクリーニングを行い、#50に特異的で、高い反応性を持つ抗体を選別した。さらに、これらモノクローナル抗体のコリバクチン産生菌への特異性を様々な大腸菌株に適応することにより検証した。また、得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ、CDR配列を決定した。エピトープ決定のためエピトープと推定される繊毛タンパク質の過剰発現株のウエスタンブロッティング、エピトープマッピングを行った。並行して繊毛タンパク質とコリバクチン産生性との関係などさらなる研究につながる#50の繊毛タンパク質のノックアウト株の作製を行った。ELISAによって選択された抗#50抗体が確実に#50を検出することを確認するために、ウエスタンブロッティングで#50抗原の検出を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
#50を免疫したBALB/cマウスより脾臓および膝下リンパ節を採取し、P3U1細胞と融合させ、抗体産生ハイブリドーマを得た。1週間培養後の上清（それぞれ1920well）の#50に対する抗体価を測定した結果、OD490値が0.09以上の値を示す陽性が膝下リンパ節では6well、脾臓では96wellであった。これらを限界希釈し、モノクローン化した753株に対して#50の抗体価を測定したところ、641株の陽性細胞を得た。これら陽性細胞に対して、#50、#Aに対する抗体価を測定した。コリバクチン陰性大腸菌株である#AのOD490値が0.1以上のものを除外し、コリバクチン陽性大腸菌#50とコリバクチン陰性大腸菌#AのOD490値の差（ΔABS）を算出し、図1-1にまとめた。限界希釈後1週間培養した細胞上清において、#50と#AのΔABS（＞0.50）が15株得られた。
様々な大腸菌株へ適応したELISAの結果をコリバクチン産生菌株、非産生菌株それぞれ吸光度の高い方から順にまとめた。コリバクチン遺伝子をノックアウトした菌株を除き、すべての非産生菌株でELISAは陰性であった。モノクローナル抗体S96-09は、すべてのコリバクチン産生菌を検出することは難しいが、コリバクチン産生菌のみを検出する精度は高いと考えられた。従って、当初の計画以上に研究が進捗した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、これら抗体を用いた免疫染色法やELISA法などによる高感度のコリバクチン産生菌の検出方法の確立を進める予定である。さらに当初の計画通りに、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所が提供する食品構成成分を含んでいる植物エキスライブラリー（10,080種類)、静岡県環境衛生科学研究所が提供する化合物ライブラリー（69,520種類）を対象に大規模なスクリーニングを行う。
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