2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of highly accurate genome editing tools aimed at creatinon of modality for gene therapy
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22K04837
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
迫野 昌文 富山大学, 学術研究部工学系, 准教授 (50391959)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / TALEN |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集の安全性向上には、一塩基の違いを正確に区別可能なレベルのゲノム編集技術が不可欠であり、ターゲット配列の厳密認識を実現するDNA結合タンパク質の構築が求められる。特に一塩基変異に伴う遺伝子疾患は多くの指定難病に見られ、ゲノム編集に基づく遺伝子修正は有効な治療法として期待できる。しかし、一塩基の違いを厳密に区別できるゲノム編集法はいまだなく、現在の技術ではターゲット細胞だけでなく正常細胞も編集対象になる危険性がある。したがって、高正確なDNA認識を実現することは、遺伝子治療の安全性向上とともに、新しい難病治療法へと発展することが期待される。
本研究で用いるTALEのプラスミド設計とタンパク質発現系構築を行った。KRAS遺伝子、WRN遺伝子の一塩基変異ホットスポットをターゲット配列として選択し、TALE発現プラスミドを設計した。この時、ターゲットDNAとのミスマッチの部位、種類も併せて検討し、解離定数の差が大きくなる組み合わせの最適化を検討した。
野生型KRAS配列を認識するTALEは、1塩基変異型配列DNA（mutGTT）と相互作用することが解析より示された。この結果は、TALEは1塩基の違いをほとんど区別できず、正常配列と同等として分子認識することを表している。そこで、連続した2塩基が異なるTALEを作製し同様の解析を行った。DNA配列とのミスマッチが2塩基連続した場合、DNAとの相互作用は大きく低下した。2塩基連続のミスマッチによる認識能低下は、正確な配列認識を持つゲノム編集ツールの開発に有用であると判断した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TALEの構築並びに相互作用解析は予定通りに行われている。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)RVDの種類とミスマッチ法への影響(2)細胞中などクラウディング条件におけるミスマッチ法の有効性を検討、の課題を中心に行っていく。
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