2023 Fiscal Year Research-status Report
感染早期発見のための生物発光指示薬の開発および体外診断法の確立
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22K05153
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
服部 満 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (20589858)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 感染症 / バイオマーカー / 発光 / 指示薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウイルスや細菌などによる感染を早期に発見するため、また検出方法が確立されていない未知の感染症に対応するため、感染に伴い上昇する様々な体内物質 (バイオマーカー) を検出する生物発光指示薬を開発し、「何かに感染している」兆候を捉える判定法を開発する。この方法を用いて、プレートリーダーのようなハイスループット検査、最終的にはスマートフォンカメラによる検査したい人が自らが行える簡便な体外診断法を確立する。
本年度は、初年度に開発したC-reactive protein (CRP) を選択的に検出して発光を呈する生物発光指示薬の改良を行った。その過程でCRPの精製方法を見直すことで、実際の検体中のCRP検出を想定した指示薬性能の正確な検証に務めた。その上で指示薬構造を変更してよりダイナミックレンジに優れた候補を選抜した。
複数のマーカーを標的として指示薬の開発、さらにはそれらを組み合わせた感染症、炎症判定システムの構築のため、次年度に向けてマーカー候補の選抜さらに検出手順の精査に取り組む。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.組換えCRPの合成
CRP検出指示薬の性能を評価する上では、CRPの使用は不可欠である。ヒトのCRPを毎度抽出することは効率が悪いため、これまで大腸菌にて合成して精製したものを使用してきた。しかしながら指示薬へ添加した際にその発光値の再現性が芳しくないため、その合成手順を検討した。指示薬は5量体CRPを検出する原理であるため精製したCRPを多量体のまま維持する必要がある。先行文献を参考にしてその抽出バッファーの組成を決定した。
2.CRP検出指示薬の改良：
前年度に設計し作製したCRP検出薬の性能評価を1.にて精製したCRPを用いて行った。指示薬は発光強度にて検出するタイプと、発光波長の変化にて検出するタイプをそれぞれ準備した。結果どちらのタイプもCRPの濃度依存的にシグナル変化が検出されたが、そのダイナミックレンジは十分ではなかった。そこで指示薬の構成を変更してそのシグナルへの影響を検討した。発光タンパク質とCRP検出ドメインを繋ぐリンカー長の変更、CRP検出ドメイン長の変更などをそれぞれ試し最適な構造を探索した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.複数の感染マーカーの選択 : CRP以外の指示薬の検出対象として、細胞破壊により増加する物質であるIL-6などのタンパク質がマーカーに適するか検討する。CRP検出指示薬の構造を基本としてとして、それぞれを特異的に検出できる生物発光タンパク質指示薬を開発する。これらを組み合わせたバイオマーカーを使用する動きは既にある一方で、それぞれの測定方法や感度は異なるため実際に実行する上では課題がある。それを解決するために、複数のバイオマーカーを同じ構造で作られた生物発光指示薬を利用して同時に計測することで、感染の疑いを複合的に判定するための検査基盤を整備する。
2.計測法の確立 : 開発した複数の指示薬による感染の判定では、医療機関においての実施を想定した多サンプルのハイスループット解析および、個人による実施を想定したスマートフォンカメラを用いた簡便な検査、の2つの計測方法を確立する。
プレートリーダーによるハイスループット計測 : ハイスループット解析にて広く用いられているプレートリーダーを用いてその解析の手順を確立する。指示薬間での発光強度の違いを補正して複合的に判定ができるよう、実際のサンプルに対してその感度とアクセシビリティを評価する。
スマートフォンカメラによる簡便計測 : PCRや抗原抗体検査による感染症の判定は、検体の郵送、もしくは医療機関へ出向く必要があり、それぞれ判定までの時間、医療機関への負担など課題がある。患者自身がまずは簡便な検査を行いその上で本格的な検査を行う、いわゆる確定前検査を実施できればこれらの課題は解決される。スマートフォンカメラでの撮影により簡便に検査できる手順を確立する。
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