2023 Fiscal Year Research-status Report
熱帯樹木由来高活性イソプレン合成酵素の探索とハイブリッド型発酵用高機能酵素の開発
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22K05195
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
屋 宏典 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 協力研究員 (10177165)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石川 岳志 鹿児島大学, 理工学域工学系, 教授 (80505909)
堀谷 正樹 佐賀大学, 農学部, 准教授 (80532134)
稲福 征志 琉球大学, 農学部, 准教授 (90457458)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | イソプレン / 合成酵素 / 活性部位 / 構造活性相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では多様且つイソプレン合成が活発な熱帯植物のイソプレン合成酵素（IspS）を広範囲に探索し、高活性を実現する分子情報を解明し、非石油資源の発酵系に適したハイブリッド型高機能IspSの設計・開発を行うことを目的とする。R5年度はIspSの遺伝子クローニングと並行して、琉球大学構内にある12種の単子葉類とこれまで既に明らかにされている熱帯樹木のイソプレン放出の温度依存性をより詳細に比較検討した。その結果、単子葉類の温度応答性は他の熱帯樹木に比べて低いことが明らかになった。単子葉類のIspSは高活性イソプレン合成酵素の供給源としては適していない可能性が高いと判断されたので、活性部位の構造特性解析に研究の方向をシフトさせた。新しく開発した分子シミュレーションを用いる方法により、イソプレン合成酵素の活性部位と基質との相互作用を詳細に検討し、これまで不明であった活性残基を同定することに成功した。また、オオバイヌビワIspSの変異体を調製し、酵素活性への影響を明らかにした。オオバイヌビワIspSの3D構造をモデリングソフトAlphaFold2により予測し、次いで、AlphaFillにより、金属原子と基質を配位したドッキングモデルを作成した。このドッキングモデルの分子シミュレーションにより、上述の活性残基との相互作用を解析することにも成功した。他方、高い温度応答性を示し、酵素学的特性も既に明らかにされているモクマオウIspSの結晶構造解析については、酵素タンパク質の結晶化には成功しているが、高分解能データの取得には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Ping Pong法による高イソプレン放出樹種の選別は概ね順調に進捗し、単子葉類を含めた熱帯樹木の中で、高活性IspSの供給源となる可能性の高い樹種を絞り込むことができた。また、構造活性相関を検討するためにオオバイヌビワIspSの変異体を調製し、変異と活性の関係を明らかにすることができた。またAIを活用したモデリングソフトであるAlphaFold2とAlphaFillを組み合わせることにより、インタクトなIspSの構造が構築可能なことも見出した。高活性IspSであるモクマオウIspSの結晶構造解析については高分解能データの取得にはいたってないものの、結晶化には成功している。実際の酵素活性の測定データと分子シミュレーションの結果の比較により、高活性を実現する分子情報が明らかになり、高活性IspSの結晶構造解析の結果と併せることにより、非石油資源の発酵系に適したハイブリッド型高機能IspSの設計・開発が可能と考えている。従って、研究は概ね順調と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
温度応答性が高く酵素学的特性も明らかにされているモクマオウIspSの結晶構造解析を引き続き行う。AIを活用したモデリングソフトであるAlphaFold2とAlphaFillを組み合わせてオオバイヌビワIspS変異株の基質とのドッキング複合体3D構造を野生型の場合と同様に作成し、基質と活性部位の反応を定量化することを試みる。次いで、酵素反応の動力学的パラメーターとの関連を調べることにより、反応速度と構造との活性相関を明らかにすることを試みる。また、モクマオウIspSについてもAlphaFold2とAlphaFillをもちいた基質－酵素複合体モデルを作成して実際の結晶構造解析の結果と比較解析することにより、分子シミュレーションの精度についての検証を行う計画である。
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| Causes of Carryover |
本年度の使用残は主に使用予定であった分子シミュレーションソフトが当初予定していたよりも廉価であったことによる。使用残額については主にクローニング実験とスクリーニング結果の検証に使用する予定である。
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