難分解性環境汚染物質である有機リン化合物を完全無毒化する微生物を創出する

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05202
• Research Institution: Hakodate National College of Technology
• Principal Investigator: 阿部 勝正 函館工業高等専門学校, 物質環境工学科, 准教授 (40509551)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 微生物分解 / 有機リン化合物 / 環境浄化 / 遺伝子組換え / バイオレメディエーション

Outline of Annual Research Achievements

Tris(2-chloroethyl) phosphateなどの塩素を含む有機リン化合物は，可塑剤や難燃材として世界各地で大量に用いられているが，難分解性であり，種々の毒性を有する．研究代表者はこれまで，含塩素有機リン化合物分解システム構築のため， TCEP分解菌 Sphingobium sp. TCM1を単離し，その分解メカニズムについて詳細に解析してきた．それら研究においてTCM1株はTCEPを分解し2-クロロエタノール(2-CE)と無機リン酸を最終産物として生成するが，2-CEを分解できないことが明らかになっている.この2-CEも毒性化合物であり， TCEPの完全無毒化を行うためには2-CEのさらなる分解が必要となる.本研究ではTCM1株に2-CE分解酵素遺伝子を導入・生産させることで，TCEPの完全無毒化が可能な新規菌株の創出を目的としている．令和4年度は以下の業績を上げた．
2-CE分解酵素の生産調節因子として用いるため，TCM1のドラフトゲノムデータベースより構成的発現遺伝子としてよく知られている，グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子プロモーターを同定した．同定したプロモーター領域遺伝子を受託により合成し，レポーター遺伝子であるlacZ遺伝子とオーバーラップPCR法により融合させた．また，同時にTCM1ホスホトリエステラーゼ遺伝子（had遺伝子）のプロモーター領域とlacZの融合遺伝子も同様に融合させ，両方の遺伝子をそれぞれ広域宿主ベクターであるpKT230MCベクターに挿入した．構築したベクターを導入したTCM1株を用いて，レポーターアッセイを試みたがTCM1株が元々有するLacZ活性が高く，今回検討した二つのプロモーターの能力については明らかにはならなかった．次年度は2-CE分解酵素であるhheC遺伝子を用いたプロモーターの解析を行う予定である．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請書に記載したとおり構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子（gap遺伝子）プロモーターを同定し，本プロモーター遺伝子とlacZ遺伝子を用いたレポーター遺伝子アッセイ系を構築できた．今回はさらに次年度予定していたTCM1株ホスホトリエステラーゼ遺伝子（had遺伝子）プロモーターのレポーター遺伝子アッセイ系も同時に構築できた．TCM1株が元々有するLacZ活性のためにプロモーターの優位性を完全に明らかにすることはできなかったが，次年度のハロアルコール脱ハロゲン化酵素遺伝子発現ベクター構築のための基盤を作ることができたことは重要な結果であり，本研究は概ね順調に進展していると判断した．

Strategy for Future Research Activity

前年度は本研究で用いるプロモーター領域の解析をおこなった．次年度は本プロモーターを用いてTCM1株中で2-CE分解遺伝子であるハロアルコール脱ハロゲン化酵素遺伝子（hheC遺伝子）を発現させ，2-CEなどの塩素を含むアルコール類を分解可能か検討する．具体的な方法を以下に示す．
gap遺伝子プロモーター，そして，TCM1株で機能することを確認している有機リン酸分解酵素(had)プロモーターを用いて2-CE分解酵素遺伝子発現ベクターを構築する．2-CE分解酵素遺伝子は，これまで単離されているハロアルコール脱ハロゲン化酵素の中でも2-CEへの反応性と分解活性が最も高いとされるAgrobacterium radiobacter AD1株のhheCを用い，使用コドンを最適化したものを受託によって合成する．目的ベクターの構築は昨年度と同様にin-fusionクローニング法で行い，hheC発現TCM1株構築後は塩素を含むアルコール類の分解挙動を解析する．含塩素アルコール類の分解についてはガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）を用いて，分解産物である塩化物イオンの遊離についてはイオンクロマトグラフィーを用いて測定する.

Causes of Carryover

当該助成金が生じた理由としては，前年度の遺伝子・分析試薬の購入が当初予測より少なかったためである．
本年度に関しては新たなベクター構築のための分子生物学実験を行なう予定である．また，含塩素アルコール類の分解活性測定においてはガスクロマトグラフィー質量分析計やイオンクロマトグラフィーも多く使用する予定であることから，その消耗品費が本年度不足する可能性も考えられる．
以上の事から，当該助成金については本年度請求した助成金と合わせて主に分析関係試薬や遺伝子関連試薬などの消耗品費として使用する予定である．