新たな分子設計概念に基づく対称性含窒素複素環化合物のバイオ生産システム

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05309
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 桝尾 俊介 筑波大学, 生命環境系, 助教 (10767122)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ピラジン / 含窒素複素環化合物 / ケモエンザイマティック合成

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題は様々なアルデヒド基質から多様な対称性含窒素複素環化合物をバイオ生産するシステムを構築するものである。これまでに、トランスアルドラーゼ
およびデヒドロゲナーゼを用いた新たなピラジン生産経路を設計し、複数のピラジン化合物を微生物生産することに成功している。また、基盤化合物である2’-5’-ジフェニルピラジンのin vitro 生産系の最適化の過程で、デヒドロゲナーゼが律速段階であることを明らかとしている。本年度は、2’-5’-ジフェニルピラジンの生産経路をモデルとして、生産効率のさらなる向上を目指し種々の検討を行った。酵素を用いたin vitro生産系、および休止菌体を用いた微生物生産系の両方について、生産物、中間代謝産物の詳細なモニタリングと、反応条件の最適化を行ったところ、律速段階であるデヒドロゲナーゼの反応ステップは、穂因子であるNADP+の不足によることを明らかとした。また、反応系中にNADP+を添加することで生産効率が上昇することを見出した。本経路では、NADP+のリサイクル経路としてNADPH オキシダーゼを利用しているが、この反応効率が不十分であることが示された。これらの知見に加え、基質として添加したベンズアルデヒドの大部分が、酸化され安息香酸へと変換されており、これが生産効率の低下につながっていることも見出した。これら二つの課題を解決するために、新たなリサイクルシステムの設計を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

生産効率を向上させるための最適化を進める過程で、これまで見えてこなかった新たな課題が生じた。すでに生産効率を前年度以上に向上させることに成功しているものの、これを解決することで更なる生産効率の向上が見込まれるため、それに係る研究を優先した。そのため、若干の遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

本年度見出した新たな課題である基質の酸化を抑制するため、その原因となる菌体内酵素の破壊に取り組む。また、反応系の通気条件の最適化を進め、基質の空気酸化を防ぐ条件を見出す。さらに、前年度までに設計した、基質の酸化とNADP+の再生を両方解決するための新たな経路の導入を進める。

Causes of Carryover

本年度秋赤となった新たな課題への対応を優先して実施し、本年度購入予定であった人工合成遺伝子の生産依頼を延期したため、次年度使用額が生じた。次年度これらを購入することで予算を使用する計画である。