2022 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism of construction and cyclization of the heme precursor tetrapyrrole
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22K05321
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
佐藤 秀明 久留米大学, 医学部, 准教授 (60271996)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
塚口 舞 (古澤舞) 久留米大学, 医学部, 助教 (40624094)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ヘム生合成 / ポルフィリン生合成 / テトラピロール / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘム生合成経路の途中では、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（HMBS）によって4分子のポルホビリノーゲン（PBG）から合成される鎖状テトラピロールが、ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（UROS）によってD環ピロールの反転を伴いながら環状化される。本研究では、これらの酵素について立体構造と溶液中での反応の両面から検討を行い、非対称な側鎖配置を持つヘムのポルフィリン環が構築される反応機構の理解を目指している。これまでにヒト由来HMBSについて、ホロ型および、補因子に2分子の基質PBGを連結した反応中間体ES2型で、基質類似体との複合体のX線結晶構造解析に成功し、鎖状テトラピロールの構築過程でPBGがどのように連結されていくのかについて考察してきた。
今年度はUROSの詳細な立体構造解析を目指して、まずは結晶の調製に取り組んだ。試料は、大腸菌で大量発現させ、各種のカラムクロマトグラフィーで精製したヒト由来UROSを用いた。基質や反応生成物を含まないUROS単独の結晶化を、シッティングドロップ蒸気拡散法で、大気下、20℃で実施したところ、微結晶やクラスターを得られる有望な結晶化条件がいくつか見つかってきた。一方、UROSと大気下で不安定な反応生成物との共結晶化も嫌気条件下で試行してきたが、これまでのところ適切な結晶化条件は見つかっていない。今後、得られた酵素単独の結晶で、また反応生成物との共結晶を得て、X線結晶構造解析を実施し、テトラピロール環状化の反応機構について考察する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究対象の酵素であるUROSおよびHMBSを結晶化するための条件の探索に手間取ったため、研究に若干の遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
【HMBSによる4分子のPBGからHMBへの縮合過程の解明】 基質PBGや阻害剤としてのPBG類似体を用いて、反応中間体であるES1~ES4型の各複合体を調製して結晶構造解析を行う。また、変異酵素の活性解析によって活性部位周辺のアミノ酸残基の役割を探る。得られる複合体の構造と変異体の活性解析の結果からHMBSの基質結合部位を明らかにし、4分子のPBGがどのように活性部位に結合し、どのアミノ酸残基がいかにして縮合反応を進めるのかを明らかにする。
【UROSによるHMBのD環反転を伴う環状化過程の解明】 UROS-反応生成物複合体の結晶構造解析を進める。また、反応の進まない基質類似体を、ピロール環のα位を修飾したPBG誘導体を共存させたHMBS酵素反応、あるいは化学合成で調製し、これを用いてUROS-基質類似体複合体の結晶構造解析を行う。得られる立体構造から基質結合に関わるアミノ酸残基を推定し、それらについての変異体を作成して、変異酵素の活性、Kmおよびkcatから各アミノ酸残基が基質結合や触媒活性に果たす役割を検討する。これによりUROSが溶液中で機能する際の基質の結合状態および反応に必要なプロトン供与体を決定し、UROSによるD環ピロール反転機構の解明を進める。
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| Causes of Carryover |
新型コロナの感染拡大に対応し、遠隔地で開催される学会への参加を見合わせたため、次年度使用額が発生した。新型コロナの収束に伴って、次年度は対面での学会開催が増えてくるであろうことから、遠隔地で開催される学会に参加するための旅費に使用する予定である。
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