新規修飾アンチセンスを用いた標的選択的なRNAグアニン四重鎖安定化法の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05326
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 萩原 正規 弘前大学, 理工学研究科, 准教授 (40403000)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: アンチセンス核酸 / グアニン四重鎖

Outline of Annual Research Achievements

グアニン塩基に富むRNA配列は、DNA同様にグアニン四重鎖構造を形成することが知られている。ゲノムから転写されたmRNA配列中に存在するグアニン塩基に富む領域は安定なグアニン四重鎖構造を形成し、リボソームによるタンパク質への翻訳過程を阻害することが近年明らかにされ、グアニン四重鎖構造は遺伝子発現等に重要な役割を果たすことが理解されつつある。本研究では、予めグアニン四重鎖を形成するように設計した配列（例えば5'-GGGtGGGtGGGtGGG）を、アンチセンス核酸の末端部に導入した新たなアンチセンス核酸を作製し、タンデム型グアニン四重鎖構造体を人工的に模倣したRNA-DNAヘテロタンデム型四重鎖構造体を設計し、RNA中へのタンデム型グアニン四重鎖構造形成能、および、タンデム型四重鎖構造形成が遺伝子発現に及ぼす影響を解析することを目標としている。本年度は　アンチセンスの5'末端側に導入したグアニン四重鎖構造の安定性に応じて、RNA中に形成されるグアニン四重鎖構造の安定性が変化することを逆転写酵素とキャピラリー電気泳動法を利用した構造解析法により明らかにした。また、アンチセンス領域を欠損させたグアニン四重鎖構造体のみでは安定なタンデム型グアニン四重鎖構造体形成は認められず、アンチセンス領域によるRNAとの配列特異的な２重鎖構造形成が、安定なRNA-DNAヘテロタンデム型四重鎖構造体形成に必要不可欠であることを明らかにした

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請者がこれまでに報告した、『グアニン四重鎖構造を誘導するアンチセンス核酸の開発』において作製した評価系（Journal of the American Chemical Society, 2010, 132, 11171-11178、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2010, 20, 2350-2353）を用いることで、速やかに本研究のコンセプトをである、モデル配列を用いたRNA-DNAヘテロタンデム型四重鎖構造体形成を評価することができた。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究結果より、グアニン四重鎖構造体修飾アンチセンス核酸はRNA構造中に安定なタンデム型四重鎖構造を誘起することにより、逆転写の過程を阻害できることを明らかにした。今後、生物学的な安定性を向上させるために、有効な化学修飾法を開発するとともに、in vito無細胞タンパク質発現系や細胞を利用し、タンパク質翻訳過程を制御可能な修飾アンチセンス核酸の開発を進めていく。

Causes of Carryover

本年度は、タンデム型グアニン四重鎖の評価のためにアンチセンスライブラリーの作成を計画していた。プレートでのDNAライブラリー合成を考えていたが、通常の合成法で効果的に構造を形成するアンチセンス核酸を見いだすことができたため、DNA合成量が当初の計画より低予算で進めることができた。アンチセンス評価法についても低容量で評価する実験系を作成することに成功し、当初の予定よりも使用する逆転写酵素、dNTPなどの量が少なく済んだため次年度繰越となった。
本年度は、昨年度見出した骨格構造を修飾しアンチセンス核酸の最適化を行う。そのため、昨年度に比べDNA合成や、合成アンチセンス核酸の生化学的評価を行うための試薬購入が大きく増加すると見込んでいる。

Research Products

• [Journal Article] Small molecule-based detection of non-canonical RNA G-quadruplex structures that modulate protein translation (2022)
  • Author(s): Yousuke Katsuda, Shin-ichi Sato, Maimi Inoue, Hisashi Tsugawa, Takuto Kamura, Tomoki Kida, Rio Matsumoto, Sefan Asamitsu, Norifumi Shioda, Shuhei Shiroto, Yoshiki Oosawatsu, Kenji Yatsuzuka, Yusuke Kitamura, Masaki Hagihara, Toshihiro Ihara and Motonari Uesugi
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 50 Pages: 8143-8153
  • DOI: 10.1093/nar/gkac580
  • Peer Reviewed