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2023 Fiscal Year Research-status Report

Development of Caribbean ciguatoxin-specific antibodies for prevention and treatment of ciguatera

Research Project

Project/Area Number 22K05332
Research InstitutionOsaka Metropolitan University

Principal Investigator

円谷 健  大阪公立大学, 大学院理学研究科, 教授 (00372855)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Keywordsシガテラ / シガトキシン / モノクローナル抗体 / 電位依存性ナトリウムチャネル / ハプテン
Outline of Annual Research Achievements

カリブ海型シガトキシン(C-CTX)は,米国大西洋やカリブ海域におけるシガテラ食中毒の主要原因毒素である。この地域におけるシガテラの予防には、魚類からのC-CTXの微量検出法を確立することが必要であるが、そのためにはC-CTXを特異的に認識する抗体の作製が必須である。本研究では、低分子ハプテンを免疫することによるC-CTXを特異的に認識する抗体の作製およびこれを用いた微量検出法の開発を目的とする。
本年度は、昨年度に引き続きリンカー部をハイドロカーボンとしたハプテンを用いたモノクローナル抗体の作成について検討した。これまでに合成したリンカー部をハイドロカーボンとしたハプテンをマレイミド法によりキャリアタンパク質(BSAおよびKLH)と縮合して抗原として免疫した。3回免疫後のマウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞とを電気細胞融合法により細胞融合した。細胞融合を数回行った結果、ハプテン-BSAを認識するモノクローナル抗体を100種類以上獲得した。これら、モノクローナル抗体について、遊離のハプテンを用いて阻害実験を行ったところ、数種のモノクローナル抗体を弱く結合することが明らかとなった。25H8について大量培養して、C-CTXとの結合力を評価したが、目的とするハプテンに対して強い結合は見られなかった。
ヴィゴ大学より供与されたC-CTXサンプルを用いて、Neuro 2A細胞を用いた細胞阻害実験を行った。その結果、EC50が8 ng/mLと高い細胞増殖阻害活性を示した。今後、この系をもちいて、抗体の結合阻害実験を行い、得られたモノクローナル抗体のC-CTXに対する結合力を評価する。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は、新たな5環性ハプテンを用いた免疫を実施することにより、数多くのハイブリドーマを獲得することに成功した。また、新たに獲得したC-CTXの細胞毒性試験を行い、従来の太平洋型シガトキシンと同等の毒性を示すことを明らかにした。これらの結果より、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

(1) C-CTX右端構造を認識するモノクローナル抗体の調製:今後、25H8を大量培養し、C-CTXに対する結合活性などを求め、機能解析する。特にNeuro 2A細胞を用いて抗体存在下における細胞毒性試験を行い、実際にモノクローナル抗体がC-CTXを認識するか評価する。
(2) サンドイッチELISA法によるC-CTXの高感度微量検出法の確立:C-CTX左端構造を認識する抗体あるいは右端構造を認識する抗体のいずれかをアルカリフォスファターゼ(ALP)で標識し、これらを用いたサンドイッチELISA法によるC-CTXの検出を検討する。高感度化を目指して、諸条件を検討し、高感度でC-CTXを検出可能な条件を見出す。

  • Research Products

    (12 results)

All 2024 2023 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 6 results,  Invited: 2 results)

  • [Int'l Joint Research] University of Vigo/IRTA(スペイン)

    • Country Name
      SPAIN
    • Counterpart Institution
      University of Vigo/IRTA
  • [Int'l Joint Research] University of Udine/University of Trieste(イタリア)

    • Country Name
      ITALY
    • Counterpart Institution
      University of Udine/University of Trieste
  • [Journal Article] Sensitive Detection of Ciguatoxins Using a Neuroblastoma Cell-Based Assay with Voltage-Gated Potassium Channel Inhibitors2024

    • Author(s)
      Yokozeki Toshiaki、Kawabata Madoka、Fujita Kazuhiro、Hirama Masahiro、Tsumuraya Takeshi
    • Journal Title

      Toxins

      Volume: 16 Pages: 118~118

    • DOI

      10.3390/toxins16030118

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Evaluation of relative potency of calibrated ciguatoxin congeners by near-infrared fluorescent receptor binding and neuroblastoma cell-based assays2023

    • Author(s)
      Yokozeki Toshiaki、Hama Yuka、Fujita Kazuhiro、Igarashi Tomoji、Hirama Masahiro、Tsumuraya Takeshi
    • Journal Title

      Toxicon

      Volume: 230 Pages: 107161~107161

    • DOI

      10.1016/j.toxicon.2023.107161

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] An approach to ciguatera research based on anti-ciguatoxin monoclonal antibodies2023

    • Author(s)
      Takeshi Tsumuraya
    • Organizer
      International Symposium in Okinawa, 2023, on Ciguatera and Related Marine Biotoxins: Post symposium of the ICHA2023 Hiroshima
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Evaluation of relative potency of calibrated ciguatoxin congeners by near-infrared fluorescent receptor binding and neuroblastoma cell-based assays2023

    • Author(s)
      Toshiaki Yokozeki, Yuka Hama, Kazuhiro Fujita, Tomoji Igarashi, Masahiro Hirama, Takeshi Tsumuraya Evaluation of relative potency of calibrated ciguatoxin congeners by near-infrared fluorescent receptor binding and neuroblastoma cell-based assays
    • Organizer
      International Symposium in Okinawa, 2023, on Ciguatera and Related Marine Biotoxins: Post symposium of the ICHA2023 Hiroshima
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Development of purification method for ciguatoxins in fish using lipid hydrolysis and application to near-infrared fluorescent receptor binding assay2023

    • Author(s)
      Toshiaki Yokozeki, Kazuhiro Fujita, Tomoji Igarashi, Takeshi Tsumuraya, Takeshi Yasumoto
    • Organizer
      International Symposium in Okinawa, 2023, on Ciguatera and Related Marine Biotoxins: Post symposium of the ICHA2023 Hiroshima
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Evaluation of differences in acid stability of ciguatoxin congeners from the Pacific by LC-MS/MS2023

    • Author(s)
      Toshiaki Yokozeki, Kazuhiro Fujita, Tomoji Igarashi, Masahiro Hirama, Takeshi Yasumoto, Takeshi Tsumuraya
    • Organizer
      The 20th International Conference on Harmful Algae (ICHA2023)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 近赤外蛍光レセプターバインディングアッセイおよびN2a アッセ イによるシガトキシン同族体の相対効力評価2023

    • Author(s)
      横関俊昭、濱悠佳、藤田和弘、五十嵐友二、平間正博、円谷 健
    • Organizer
      第17回バイオ関連化学シンポジウム
  • [Presentation] Rationally Designed Synthetic Haptens to Generate Anti-Ciguatoxin Monoclonal Antibodies, and Development of a Practical Sandwich ELISA to Detect Ciguatoxins2023

    • Author(s)
      Takeshi Tsumuraya
    • Organizer
      OAC INTERNATIONAL 137th Annual Meeting & Exposition
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Evaluation of relative potency of calibrated ciguatoxin congeners by near-infrared fluorescent receptor binding and neuroblastoma cell-based assays2023

    • Author(s)
      Toshiaki Yokozeki, Yuka Hama, Kazuhiro Fujita, Tomoji Igarashi, Masahiro Hirama, Takeshi Tsumuraya
    • Organizer
      AOAC INTERNATIONAL 137th Annual Meeting & Exposition
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 近赤外蛍光レセプターバインディングアッセイおよびN2aアッセイによるシガトキシン同族体の相対効力評価2023

    • Author(s)
      横関俊昭、濱悠佳、藤田和弘、五十嵐友二、平間正博、円谷 健
    • Organizer
      2023 AOAC Japan Section

URL: 

Published: 2024-12-25  

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