2022 Fiscal Year Research-status Report
細菌のタンパク質コンパートメントを基にした機能性人工シェルの創成
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22K05334
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
佐々木 栄太 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 講師 (00803157)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | タンパク質シェル / 人工タンパク質 / ルマジン合成酵素 / DDS / 分子進化 / バクテリアルマイクロコンパートメント（BMC） |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの細菌は、その細胞内にタンパク質の殻(シェル)構造で区画化された空間をもち、物質の貯蔵、生産、輸送などの多様な生命現象に利用している。本研究では、これら細菌由来のタンパク質コンパートメントの人工利用への道を拓くことを目指し、ゲノムデータから得られる多様なシェルタンパク質を遺伝的に改変または進化させることにより、標的とするタンパク質を取り込みながら自発的にシェルを形成する新たな機能性人工シェルを創成することを目的とした。
本年度はまず、60量体からなるシェル構造を形成する超好熱菌 Aquifex aeolicus由来のルマジン合成酵素（AaLS）を改変し、大腸菌内で共発現させた標的タンパク質を自発的かつ特異的にシェル内に取り込むシステムを構築した。具体的には、AaLSシェル内腔側に位置するループ構造に13アミノ酸からなるSpyTag配列を挿入し、これと相互作用するSpyCatcherドメインを融合したsfGFPを大腸菌内で共発現させた。ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、動的光散乱、透過型電子顕微鏡を用いた解析によって、AaLS改変体は野生型と同じ直径16 nmのシェル構造（S型）に加えて、直径29 nmのシェル構造（L型）も形成するという興味深い結果を得た。さらに、紫外・可視分光光度計を用いた解析によって、S型、L型のいずれのシェル構造にも期待通りSpyCatcher融合タンパク質を自発的に内包可能であることを明らかとした。以上、本研究によって、標的タンパク質を自発的かつ特異的に内包可能な人工タンパク質シェルの開発に成功した。本研究成果は、人工タンパク質シェルを用いた効率的な物質生産や薬物送達システムへの応用基盤となることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌内で共発現するだけで、標的タンパク質を自発的かつ特異的に内包可能な人工タンパク質シェルが、設計通り機能したため。標的タンパク質を内包可能なAaLS改変体としては、これまでに、負電荷を帯びたアミノ酸変異を導入することによって、正電タグをもつ標的タンパク質を内包可能なものが報告されていた。しかし、静電相互作用に基づく内包システムでは、その原理的に非特異的な内包が問題になり得ると考え、本研究では静電相互作用ではなく、特異性の高い相互作用システムであるSpyTag-SpyCatcherを用いることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
標的タンパク質を内包可能な人工タンパク質シェルを効率的な物質生産や薬物送達システムへとつなげるためには、本シェルの安定性を精査することが不可欠である。そこで、将来的な生体への応用を見据え、血漿中や細胞内の環境を模した条件下での人工タンパク質シェルの安定性評価を行っていく予定である。また、人工利用可能なタンパク質シェルのバリエーションを拡充させるために、さまざまな大きさや性質をもつバクテリアルマイクロコンパートメント（BMC）由来の人工タンパク質シェルの開発を目指す。さらに、外部刺激に応答して内包物を放出するような機能をもつ人工タンパク質シェルの創成にも取り組む予定である。
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