2022 Fiscal Year Research-status Report

Creation of caged peptides possible for dissociation from target and switching target upon photo-irradiation

Research Project

Project/Area Number	22K05348
Research Institution	Japan Advanced Institute of Science and Technology
Principal Investigator	渡邉貴嘉北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 講師 (70554020)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	ペプチド / ケージド化合物 / 非天然アミノ酸 / 進化分子工学 / SELEX
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、光照射によって標的分子から解離する「OFF型ケージドペプチド」および光照射によって標的分子から解離したペプチドが別の標的分子に結合するようになる「標的スイッチ型ケージドペプチド」の創製を目指して研究を進めている。令和4年度は、まず複数のケージドアミノ酸誘導体を化学合成し、質量分析によって合成を確認した。次に、アンバーサプレッション法を用いてケージドアミノ酸をペプチドに導入した。実際には、化学的アミノアシル化法でアンバーサプレッサーtRNAにケージドアミノ酸を結合させ、アンバーコドンを持つペプチド発現mRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドアミノ酸導入ペプチドを発現させた。発現させたペプチドの一部に365 nm光照射を行い、光照射前後のペプチドの質量分析を行ったところ、ケージドアミノ酸導入ペプチドの発現および光照射によるケージド基の脱離を確認した。続いて、ケージドアミノ酸を組み込んだペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能か評価した。具体的には、ランダムコドン配列を含むmRNAライブラリを作製し、ピューロマイシンリンカーをハイブリダイズさせた。そして、ケージドアミノ酸-tRNAとともに無細胞翻訳系に加えることで、ケージドペプチド-cDNA複合体ライブラリを作製した。その後、モデル実験として抗FLAG抗体に対するケージドペプチドのセレクションを行い、得られたペプチド-cDNA複合体の塩基配列を次世代シーケンサー（NGS）で解析したところ、FLAGペプチドのエピトープ領域にケージドアミノ酸が組み込まれたペプチド配列が有意に濃縮・回収された。このことから、今回構築したペプチドライブラリを用いてケージドペプチドのセレクションが可能であることを実証した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ケージドアミノ酸の化学合成、ケージドアミノ酸を組み込んだペプチドライブラリの構築とケージドペプチドのセレクションが可能であることを実証でき、OFF型ケージドペプチドおよび標的スイッチ型ケージドペプチドのセレクションに向けた研究基盤を構築できたことから、ここまでは当初の計画以上に研究が進展していた。しかし、研究代表者の研究拠点の異動が急遽決まり、異動準備のため一時的に研究活動を停止していたため、これまでの研究実績を勘案しておおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	引き続き、様々なケージドアミノ酸を化学合成しcDNAディスプレイ法に組み込むことで、ケージドペプチド-cDNA複合体ライブラリの構築を継続する。そして、構築したライブラリを用いて、まずはOFF型ケージドペプチドの取得を行う。標的分子Aを固定化したビーズにケージドペプチド-cDNA複合体ライブラリを加え、標的分子Aに結合したものを分別する。その後、光照射によりケージド基を脱離させ、標的分子Aから遊離するペプチド-cDNA複合体を回収する。回収されたcDNAの定量・PCR増幅を行ったあと、再びこれらの操作を数回繰り返し、得られたペプチド-cDNA複合体の塩基配列を次世代シーケンサー（NGS）で解析することでアミノ酸配列を同定する。次に、標的スイッチ型ケージドペプチドの取得を行う。まず、標的分子Aに結合するケージドペプチド-cDNA複合体を回収する。その後、一旦ビーズから遊離させ、そこに標的分子Bを固定化したビーズを加えて、ケージド状態では標的分子Bに結合しないものを回収する。そして光照射によりケージド基を脱離させたあと、標的分子Bに結合するペプチド-cDNAを回収することで、標的スイッチ型ケージドペプチドの取得を目指す。
Causes of Carryover	研究代表者の研究拠点の異動が急遽決まり、異動準備のため一時的に研究活動を停止していた。そのため、試薬・消耗品の使用量が当初の見込みより少なくなり、さらにセレクションで使用する標的分子の購入等を進められなかったことから、次年度繰越金が生じた。使用計画としては、遺伝子工学実験、タンパク質発現実験等で必要な試薬・消耗品、ケージドペプチドのセレクションで使用する標的分子を購入するための物品費、情報収集や学会発表のための旅費、次世代シーケンサー（NGS）解析の外注費に充てる。