2022 Fiscal Year Research-status Report
タイト結合リガンドが呈した細胞間隙開裂型マクロ飲作用の機序理解と癌静穏化の新戦略
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22K05357
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
幸野 貴之 札幌医科大学, 医学部, 講師 (10374563)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 上皮細胞 / 細胞重層化 / 癌細胞の休眠 / 癌悪性化 / 子宮内膜癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌遺伝子を有する上皮細胞のうち，子宮内膜癌細胞株Sawanoはその増殖過程で安定な上皮構造を維持する期間がある。この上皮機能を有する過程では，タイト結合関連タンパク質LSRは3細胞が会合する領域に集積する。さらにLSRはその領域にタイト結合タンパク質Tricellulinを集積させ，安定なタイト結合と完全な上皮バリア機能の構築に中心的に関与する。科研費基盤研究（Ｃ）19K05736から引き続き，さらに本研究課題において，LSRリガンドがLSRに作用することでマクロピノサイトーシスが誘導されることを示してきた。安定な上皮形態をとるSawano細胞に対して，LSRリガンドを投与すると，LSRは3細胞間領域から排除されて2細胞間領域へと移動し，さらに細胞内領域へと内在化した。LSRの内在化にはRab５との共局在が関与することを明らかにした。また，LSRリガンドの投与に依存的に隣接細胞間接着領域の部分的な開裂を伴う大規模なマクロイピノサイトーシスが形成された。その後，Sawano細胞は急激に細胞運動能を亢進させた。それに引き続いて細胞増殖能が亢進し，その結果単層上皮形態が崩壊して重層化増殖を開始した。これらの知見は，癌遺伝子を有する上皮細胞が安定な上皮構造を有する時期から悪性化増殖を開始する時期へと変遷する過程には，LSRの3細胞間領域からの局在変化が関与することを示すものである。また，その過程にマクロイピノサイトーシスが必須であることも明らかになった。このように，LSRは癌細胞の悪性化転移開始スイッチであることが明らかになりつつある。本研究では，その過程の詳細な機序解明に取り組んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1回膜貫通型タンパク質LSRに依存的に制御される細胞内情報伝達経路を解析するために，2022年度までに，Sawano細胞においてLSR遺伝子のノックアウト細胞を作成した（LSR-KO）。この細胞の形態解析や上皮機能の解析，LSRが関与する細胞機能への影響などを解析している。
①LSR-KO細胞の作成について：LSR-KO細胞はCRISPR-Cas9のシステムに基づいて作成した。取得した細胞はシングルクローンに由来する株であり，これらLSR-KO細胞を複数株樹立した。
②得られたLSR-KO細胞について，隣接細胞間の接着領域に着目して透過電顕により形態解析を行った。さらに，上皮バリア機能を経上皮電気抵抗値の測定により評価した。
③得られたLSR-KO細胞について，タイト結合タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により解析した。検討したタンパク質は，LSR, Tricellulin, occludin, claudinsなどである。
④得られたLSR-KO細胞について，細胞増殖能や細胞運動能の解析を生細胞イメージングにより行った。さらに，細胞周期解析なども実施した。これらの研究は当初の研究計画から大きく外れるものではなく，おおむね順調に進行していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画に沿って研究を推進する。研究課題名である，タイト結合リガンドが呈した細胞間隙開裂型マクロ飲作用の機序理解と癌静穏化の新戦略，に対して，2022年度研究で樹立したLSR-KO細胞を積極的に活用して解析を進める。まず，LSR-KO細胞と野生型細胞とでの遺伝子発現の違いをマイクロアレイにて網羅的に解析する。ここでは，再現性や正確性を重視するため，信頼のおける解析機関に解析を依頼する。得られた発現プロファイルをもとに，LSRが関与する細胞機能および情報伝達経路について分子生物学的な解析を行う。2022年度研究では，LSR-KO細胞において顕著な細胞運動能の亢進と細胞周期の亢進が観察されている。そこで，これらの機能制御に焦点を絞って解析を進める予定である。研究の成果や進捗状況は，6月の日本細胞生物学会や9月の日本臨床分子形態学会，または12月の日本分子生物学会にて発表することを検討する。
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| Causes of Carryover |
研究計画の策定段階では，2022年度は，細胞培養器具及び関連試薬代，遺伝子・生理活性物質解析費，抗体・阻害剤購入費として，70万円を計上し，また，旅費として20万円を，その他論文作成に要する費用等として10万円を計上した。これらのうち，当初購入予定だった抗体等を用いた研究については次年度以降に行うこととしたために，本年度研究期間内には予算を執行しなかった。また，それに伴って発表する予定だった学会参加や論文執筆も次年度以降に実施することとなった。次年度は本年度先送りした各費目を次年度分と合わせて使用することとしたが，これに伴って次年度の研究計画が大幅に変更されることはなく，また研究計画全体の研究経費の変更は生じない。
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