2022 Fiscal Year Research-status Report

Exploring the periplasmic chaperone network underlying outer membrane protein folding

Research Project

Project/Area Number	22K05387
Research Institution	Yamagata Prefectural Yonezawa University of Nutrition Sciences
Principal Investigator	成田新一郎山形県立米沢栄養大学, 健康栄養学部, 教授 (30338751)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	外膜タンパク質 / シャペロン / プロテアーゼ / 細菌細胞表層 / 表層ストレス応答
Outline of Annual Research Achievements	グラム陰性細菌の外膜に存在するβ-バレル型の外膜タンパク質は、ペリプラズム空間に存在する種々のシャペロンの働きで外膜まで運ばれた後、BAM複合体の作用により外膜に局在化する。本研究課題は、ペリプラズム空間に存在する種々のシャペロンがどのように協調し、外膜タンパク質のフォールディングを支えているかを明らかにすることを目的としている。令和4年度はペリプラズムシャペロンBepAの活性測定系の構築を進めるとともに、BepAと機能面で相互作用する因子を遺伝的相互作用を利用して選択した。 BepAはシャペロン活性とプロテアーゼ活性を併せ持つタンパク質であり、外膜タンパク質であるLptDの生合成の促進と品質管理を介して外膜の機能的完全性の維持に寄与している。これまでに構築されていたBepAの活性測定系では、BepAと基質タンパク質を試験管内で一定時間混合して反応させた後、分解されたタンパク質をSDS-PAGEを用いて検出することによって行われており、基質特異性や反応速度論的パラメータに関する情報は得られていなかった。本研究ではBepAのプロテアーゼ活性部位を覆っているループ領域を欠くBepAΔα9変異体を用いるとともに、消光性蛍光ペプチドを基質として用いることで、BepAの基質特異性を解析する実験系の構築を行った。その結果、BepAによって基質として認識され分解されやすいペプチドのアミノ酸配列に関する情報が得られた。 BepAを中心としたペリプラズムシャペロンネットワークを解明するために、bepA遺伝子と遺伝的に相互作用する遺伝子の探索を行った。bepAを欠失する大腸菌変異株の薬剤感受性を抑制するサプレッサー変異株のゲノムシーケンス解析を行った結果、変異遺伝子が特定され、BepAと相互作用する新たな因子の発見につながる手掛かりが得られた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の目的の一つに、シャペロン活性とプロテアーゼ活性を併せ持つBepAの機能をin vitroで検出する実験系を構築することがある。令和4年度はBepAのシャペロン活性を定量的に測定するin vitro実験系の構築には至らなかったが、BepAα9変異体と消光性蛍光基質ライブラリーを用いることで、プロテアーゼとしてのBepAの基質特異性に迫ることが出来た。また、ペリプラズムシャペロンをコードする遺伝子間の遺伝的相互作用を解析することによってシャペロン間の機能面での相互作用を探索する試みでは、サプレッサー変異株の単離からbepA遺伝子と遺伝的に相互作用する遺伝子を同定することができ、今後解析を進める上での重要な手掛かりを得ることができた。以上のような進捗状況を勘案し、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	リンゴ酸脱水素酵素などのモデル基質を用いてBepAのシャペロン活性を定量的に測定できる実験系の構築を行うとともに、令和4年度に得られたBepAの基質特異性に関する情報を参考にしながら、LptDなどの生理基質を用いたBepAのシャペロン／プロテアーゼ機能をin vitroで再構成する実験系の構築を試みる。また、bepA欠失株の薬剤感受性を抑制する変異に関する情報を手掛かりに、多重欠失変異株などの構築を進めてペリプラズムシャペロンネットワークに迫るとともに、外膜の機能をリアルタイムかつ定量的に解析する手法を検討し、これらの変異が外膜の機能に及ぼす影響を明らかにする。
Causes of Carryover	当初の計画では、BepAのシャペロン機能の生化学的解析を予定していたが、BepAのプロテアーゼ機能の基質特異性の検討、およびサプレッサー変異株の解析に時間を費やした。このため、当初予定していた実験に使用する予定であったモデル基質などの試薬等の購入を見合わせた。令和5年度はBepA変異体の精製、及びそれらを用いたシャペロン活性測定実験、およびBepAと相互作用する遺伝子の変異株作製に必要な試薬・消耗品の購入に次年度使用額を充てる。