2022 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子発現と微生物間相互作用から迫る糸状菌細胞壁多糖ニゲランの機能
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22K05410
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
上地 敬子 琉球大学, 農学部, 助教 (70733426)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ニゲラン / 窒素源飢餓 / Aspergillus luchuensis / 遺伝子発現 / 転写調節因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
泡盛醸造に用いられる黒麹菌Aspergillus luchuensisは窒素飢餓条件下でニゲランという細胞壁多糖を合成する。研究代表者は窒素源含有/飢餓条件下での遺伝子発現解析等を実施し，ニゲラン合成酵素遺伝子クラスターを発見し，報告した。しかしながら，黒麹菌等のニゲラン生産糸状菌がなぜニゲランを生産するのか，あるいは糸状菌におけるニゲラン生産の生理学的な意義について解明するまでには至らなかった。そこで本研究課題では遺伝子発現解析に加えて，ニゲラン生産糸状菌とニゲラン資化（分解）細菌の相互作用解析を通じて，糸状菌におけるニゲラン生産の意義を理解するための知見を得ること目的とした。初年度はA. luchuensisの窒素源代謝に関わる，あるいは遺伝子発現解析で窒素源飢餓時に転写量が有意に増加した転写調節因子をコードする遺伝子破壊株を作製し，ニゲラン生産能への影響について検証した。つづいて，ニゲラン合成酵素遺伝子のプロモーター領域を含むと推測される当該遺伝子の上流領域をクローニングし，レポーターアッセイを試みた。また先行研究より，枯渇する窒素源の種類によってニゲラン生産量が変化すると報告されていたため，窒素源の種類を変えてA. luchuensisを培養してニゲラン生産量を比較した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
A. luchuensisの窒素源代謝に関わる，あるいは遺伝子発現解析で窒素源飢餓時に転写量が有意に増加した転写調節因子をコードする遺伝子破壊株，計13株を作製してニゲラン生産能を検討した。その結果，窒素源飢餓時に二次代謝物合成に関わる数百もの遺伝子発現を調製する広域転写活性化因子をコードする遺伝子（areA）を破壊した株はニゲラン生産能を完全に失うことが明らかとなった。そのため，ニゲラン合成酵素遺伝子の発現はAreAによって直接的あるいは間接的に制御されていることが強く示唆された。ニゲラン合成酵素遺伝子の上流域にはAreAが結合すると推測される領域が存在した。ニゲラン合成酵素遺伝子の上流域に続いてβ-グルクロニダーゼ遺伝子(uidA)を連結させたプラスミドを構築し，形質転換したA. luchuensisを用いてレポーターアッセイを行った。遺伝子の導入は確認できたものの，組換えタンパク質は発現しなかった。その原因については現在調査中である。
先行研究で枯渇する窒素源の種類によってニゲラン生産量が異なると報告されていたため，窒素源の種類を変えてA. luchuensisを培養してニゲラン生産量を比較したが，有意な差は確認できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
レポーターアッセイについては，プラスミドの再構築を試みて遺伝子導入領域を変更して再試験を行う。併せて窒素源飢餓時にAreAが転写調節を行うことが報告されている遺伝子の上流領域を持つプラスミドをポジティブコントロールとして構築して試験する。β-グルクロニダーゼ（GUS）活性が確認され次第，ニゲラン合成酵素遺伝子の上流域の長さを変えてどの領域がGUSの発現に重要であるか明らかにする。
当初，窒素源の種類を変えてA. luchuensisを培養することでニゲラン生産量が変化すると想定していた。またそれは枯渇する窒素源の種類により転写開始点がかわりニゲラン合成酵素遺伝子の発現量が変化するためだと予想しており，転写開始地点の解析に力を発揮するCAGE-seqを行う予定であったが，いったん保留とした。本項目に関連して，一度ニゲランを生産させた状態（窒素源飢餓条件下で培養）に窒素源を添加することでニゲラン分子量が低下する現象が確認された。糸状菌のニゲラン分解システムの解明については，研究代表者も取り組んでいるところだが，これを担う酵素遺伝子は同定できていない。糸状菌におけるニゲラン合成に加えて，分解システムを理解する事は糸状菌のニゲラン代謝全体を理解する上で必要不可欠であると考えた。そのため当初の予定を変更して，遺伝子発現解析等を実施して糸状菌のニゲラン分解系について検証を進めていく予定である。
また，次年度は土壌中の窒素源含有量を変えてA. luchuensisのニゲラン合成酵素遺伝子の発現をRT-PCRでモニターするとともに，ニゲラン合成時にGFP等の蛍光タンパク質が発現する株の作製を試みる。
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| Causes of Carryover |
当初，遺伝子発現解析（CAGE-seq）の外注費を見込んでいたが，培養条件によるニゲラン量の差異が小さく，CAGE-seqに供しても比較に値する解析結果が見込めないと判断した。そのため次年度使用額が生じた。次年度使用額については，再度レポーターアッセイ系を構築するため，その基質や遺伝子工学実験に必要な試薬類の購入費に充てる。
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