Elucidation of the biogenesis mechanism of amine dehydrogenase by development of a low-cytotoxicity genome editing technique for bacteria

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05419
• Research Institution: Hiroshima Institute of Technology
• Principal Investigator: 中井 忠志 広島工業大学, 生命学部, 教授 (00333344)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / 補酵素の生合成 / タンパク質工学 / 酵素触媒機構 / Paracoccus denitrificans / 広宿主域ベクター / 発現制御機構 / 翻訳後修飾

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、タンパク質の翻訳後修飾反応により形成されるビルトイン型キノン補酵素、システイントリプトフィルキノン（CTQ）を有するキノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素（QHNDH）を対象とした。特に、最後まで未解明のままになっているCTQの生成機構を明らかにすることで、多段階の翻訳後修飾反応によるQHNDHの生合成プロセスを統合的に解明することと、QHNDH生産菌であるParacoccus denitrificansに適用可能な細菌の低細胞毒性ゲノム編集技術を確立することも目的とした。
2022年度は、広宿主域ゲノム編集用プラスミドの構築を中心に研究を実施した。プラスミドベクターとして広宿主域のpBBR122およびpRK415を用いた。Cas9遺伝子は約5000 bpと大きいが、5分割した各断片をpUC19にクローニングした後、Golden Gate Assembly法により再結合すると同時にベクターに挿入した。各断片をクローンごとに改変してから再結合が可能で、複数遺伝子の融合が必要なプラスミドでも無理なく構築できることを確認した。次に、IPTGまたは無水テトラサイクリンの培地への添加により広宿主で発現誘導可能なゲノム編集用プラスミドを構築した。まずは大腸菌に導入し、塩基編集法およびプライム編集法によるlacZ遺伝子の編集を試みたところ、ゲノムに意図する変異を導入できることを確認した。一方、P. denitrificansでの誘導時には、これらプロモーター活性が低いことが判明したため、プロモーターおよびオペレータ配列の最適化を現在進めている。今後は、決定した最適配列に置き換えたプラスミドをP. denitrificansに導入し、qhp遺伝子に変異を導入しQHNDHの翻訳後修飾機構の解析に用いる予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2022年度に構築した広宿主域ゲノム編集用プラスミドは大腸菌とP. denitrificansへの導入が可能であり、それらの形質転換体の取得にも成功したが、ゲノムへの変異導入については大腸菌のみにおいて確認できた。P. denitrificansにおいて変異導入できなかった理由としては、使用したプロモーターが誘導時に活性が低くCas9の発現が不十分である可能性が高い。そのため、プロモーターおよびオペレータ配列の最適化で試行錯誤をする必要があり、当初の計画よりもやや遅れていると言わざるを得ない。とはいえ、目的の達成には大腸菌以外の幅広い細菌（特に、P. denitrificans）で制御可能なプロモーターを開発する必要があるので、重点的に進めたい。

Strategy for Future Research Activity

上述したとおり、本研究の目的の達成には大腸菌以外の幅広い細菌（特に、P. denitrificans）で制御可能なプロモーターを開発する必要があるので、重点的に進めたい。しかしながら、より汎用的なゲノム編集の制御を行うためには、プロモーターの発現制御だけでは不十分な可能性も考えられる。そこで、研究計画にも含めていたように光誘導型ゲノム編集技術の確立についても並行して実施する。その場合には、汎用性のある恒常的なプロモーターを用いることができるので発現については容易に行えることが予想される。しかし、Cas9自体の細胞毒性が問題となることが想定される。そこで、光誘導型蛍光タンパク質Dronpaを融合させたCas9を用いる。500 nmの水色光で活性化、400 nmの紫色光で不活性化ができるので、細胞毒性を抑えつつ、大腸菌やP. denitrificansを対象にゲノム編集を行えるかについても試験を実施したい。

Causes of Carryover

56,236円の次年度使用額が生じた。その理由としては、上述したように当初の計画では予定していなかったプロモーターおよびオペレータ配列の最適化という試行錯誤を行う必要があったため、当初の計画よりも研究がやや遅れていることがあげられる。次年度に研究が進展すれば、遅れていた実験内容を実施することになるので、そこで予定していた内容の支出を行いたい。