2022 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of birefringent abnormal organelles that provide a new perspective on proteolytic dysfunction
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22K05432
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
白石 博久 岩手医科大学, 薬学部, 特任教授 (80393156)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 線虫 / p97 / VCP / CDC-48 / 複屈折性 / 多系統蛋白質症 / オルガネラ異常 / タンパク質分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
VCP/p97というタンパク質は、酵母から哺乳類まであらゆる真核生物が有しており、細胞内のタンパク質分解を始めとする様々な細胞機能に関わっている。それ故に、その機能不全は、異常タンパク質の凝集・蓄積を生じ、神経・筋変性疾患など種々の遺伝性疾患（多系統蛋白質症）の発症につながる可能性が報告されている。申請者らは、線虫（C. elegans）というモデル生物を用いた解析から、線虫のVCP/p97であるCDC-48の発現を抑制することによって、複屈折性（偏光観察という特殊な顕微鏡観察で白く輝く）を有する特徴的なオルガネラが異常に肥大化し、腸細胞内に蓄積することを見出した。このオルガネラレベルでの新しい異常を指標に、生体内における複屈折性オルガネラの実体解明を試み、細胞内タンパク質分解異常に関連した新たな疾患モデルとしての可能性を提示すべく本研究を進めている。
初年度は、まず、研究計画[1]に挙げていた「線虫cdc-48の発現量と複屈折性異常顆粒形成との関連を明らかにする」ことを目的として、線虫が有する2つのcdc-48遺伝子（cdc-48.1およびcdc-48.2）の遺伝子発現量をリアルタイム-PCR法で比較する系を構築した。これにより、複屈折性異常顆粒の形成には、予想通り、cdc-48.1もしくはcdc-48.2の全長遺伝子（ORF）を用いたRNAiによる両遺伝子の部分的な発現抑制（off-target効果）が起きていることが明らかとなった。更に、研究計画[2]の「複屈折性異常顆粒形成に関与する関連因子の探索」 を目的として、正常な複屈折顆粒の形成に必要な複数の細胞内輸送因子が、複屈折性異常顆粒の形成にも必須であることを見出した。これにより、CDC-48の機能不全に伴う異常オルガネラの形成も、正常な複屈折顆粒の形成に関わる因子群の制御下にあることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究計画に掲げていた[1]、および[2]の一部については、研究実績の概要に示す通り、順調に進展している。また、[2] VCP/p97（線虫CDC-48）の種々のコファクター候補因子と複屈折性異常顆粒形成との関わりについても解析を進めている。一方、[1][2]と併せて、異常顆粒の性状と構成成分を同定する（研究計画[3]）のための準備として、複屈折顆粒単離のための手法の検討を掲げていたが、次年度に持ち越すこととした。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に進展の得られたCDC-48.1およびCDC-48.2の発現量と複屈折性異常顆粒形成との関係については、異常オルガネラ出現を引き起こす両タンパク質の量やバランスをより詳細に解析する。また、CDC-48の種々のコファクター候補と異常オルガネラ出現との関係についても、引き続き当該因子の変異体やRNAiを用いて解析を行う。
加えて、複屈折性異常顆粒の性状および構成成分の同定に向けて、各種オルガネラマーカー発現線虫を用いて複屈折性異常顆粒の膜成分の由来を探るとともに、複屈折性異常顆粒に含まれる生体分子を同定するため、複屈折性を指標に線虫破砕液から複屈折性顆粒を単離し、質量分析による成分分析を行うための実験系を確立する。
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| Causes of Carryover |
初年度に予算を計上していた腸細胞内顆粒単離のためのピッキングシステムについては、上述の経緯により、最終的な機器選定にあたっての検討を次年度に繰り越した。また、研究費申請時に想定していた経験値の高い実験補助員は他所での雇用により採用が叶わなかったため、引き続き適当な人材を探す。
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