2023 Fiscal Year Research-status Report

セレウス菌芽胞の圧力ストレス応答における不活性化誘起因子の分子論的・形態学的解析

Research Project

Project/Area Number	22K05502
Research Institution	Kansai Medical University
Principal Investigator	前野覚大関西医科大学, 医学部, 助教 (70570951)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	金折賢二京都工芸繊維大学, 分子化学系, 准教授 (30273543)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	セレウス菌芽胞 / 高圧力殺菌 / 芽胞不活性化 / 高圧NMR / 高圧蛍光顕微鏡
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、「病原性菌芽胞の発芽を強く阻害する物理的あるいは生化学的因子を特定し、究極的にはあらゆる菌種に適用可能な万能型芽胞不活性化法を確立する」ことを目的に進めている。「物理的ストレス応答におけるリアルタイムでの生化学的・構造的変化の可視化」を目的として、1年目は病原性セレウス菌の成熟芽胞を使い、外部刺激により不活性化する過程で生じる生化学的変化を調べた（圧力ストレス応答に伴う芽胞漏出成分の検出および解析）。これまでの研究で確立した、高圧NMR法を用いたリアルタイムでの圧力ストレス応答観測法を応用し、セレウス菌芽胞への圧力効果を分子レベルで観察した結果、モデル系である納豆菌芽胞とは異なる内在性プローブ分子DPAの漏出が認められた。そこで2年目は、1年目と同様にNMR法を用いた熱ストレス応答に伴うDPAの挙動変化を調べた。その結果、圧力と熱では芽胞ストレス応答の分子漏出過程における挙動（特に時間スケール）が異なっており、この事実は各環境刺激が作用する箇所あるいはターゲットが違うことを示唆している。また並行して、芽胞からの内在成分漏出過程においてDPA以外のプローブ分子が存在するかを調べたが、現在のところNMRデータベースで同定される新規成分は見つかっていない。続いて、高圧顕微鏡を用いたバイオイメージング法によりストレス刺激に伴い生じる芽胞構造の損傷度を評価した。細胞死をチェックする蛍光プローブ（PI）を使いモデル系での挙動を確認したところ、2000気圧を印加後10分以内に細菌芽胞外殻構造の損傷が起こり、その後の増殖能試験によって高度な不活性化が認められた。また加圧処理後の芽胞外殻構造を電子顕微鏡で観察したところ、本来は扁長楕円体である芽胞体の中心部が大きく凹んでおり、この顕著な外殻構造変化は熱処理後のそれとは明らかに異なっていた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 物理ストレス（圧力/熱）を印加しながら高圧蛍光顕微鏡によるライブイメージングをおこなったが、当初の想定よりも蛍光試薬の発色が悪く、解像度を上げるよう試行錯誤を続けているため十分なデータ量の蓄積ができていない。
Strategy for Future Research Activity	3年目は、芽胞漏出過程の分子動態を評価するためのプローブ分子の探索およびデータベースを用いた分子同定を行う。また、高圧蛍光顕微鏡を用いたバイオイメージング法と電子顕微鏡観察を組み合わせ芽胞構造損傷度の評価を進め、芽胞内膜構造の損傷が物理刺激後のどの時点で発生するか、特にバルク水侵入との連動性を重点的に検証していく。
Causes of Carryover	3年目に欧州への学会出張を予定している。昨今の円安および世界的な物価高騰を勘案し、十分な旅費を確保するために繰越を行った。繰り越した助成金は旅費として使用する計画である。