2023 Fiscal Year Research-status Report
Can plant-derived proteoglycans replace animal-derived proteoglycans?
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22K05508
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
野村 義宏 東京農工大学, 農学部, 教授 (10228372)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | プロテオグリカン / アラビノガラクタンプロテイン / コンドロイチン硫酸 / 皮膚線維芽細胞 / 表皮角化細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物に含まれるアラビノガラクタン-プロテイン(AGP)はコアタンパク質にヒドロキシプロリンをもち、ガラクトースまたはアラビノースからなるアラビノガラクタン(AG)の分岐鎖が結合した構造をとる。AGPは、イオン交換クロマトなどを用いて植物から分離されていた。しかし、従来の方法ではAGPとAGを完全に分離することが困難であった。昨年度の研究で、疎水クロマトによってアラビアゴムからAGを除いたAGPを分画し、皮膚細胞に対する影響について検討を行い、ヒト表皮角化細胞(HaCaT)とヒト真皮線維芽細胞(HFB)へAGPを添加し、遺伝子発現量およびヒアルロン酸(HA)産生量への影響について検討した。その結果、真皮細胞へのAGP添加によりヒアルロン酸産生が高くなることが確認できた。表皮細胞へのAGP添加では、HA合成酵素の遺伝子(HAS2)の発現増加およびHAの産生量が増加することを確認しし、この結果をファンクショナルフード学会誌に投稿した。
今年度はAGPの精製効率を検討することを目的とし、疎水およびイオン交換クロマトによる分画方法を比較した。アラビアゴムを疎水性担体に吸着させ、塩化ナトリウム濃度を段階的に低くした溶液で溶出することでAGP分画物を得た。陽イオン交換および疎水クロマトを組み合わせることで、より効率的にAGPを分画できる可能性が示唆された。
動物由来プロテオグリカン(PG)に関する研究は、サメ頭部軟骨、シャケ氷頭、クジラ鼻軟骨、トリヤゲン軟骨および豚気管軟骨からPGを調製し、その構造の違いを検討した。水生動物由来のPGに結合しているグリコサミノグリカン(GAG)は、陸生動物由来PGに比べ硫酸化度が高いものであった。サメPGは0、4および6硫酸の比率が同じであるが、シャケPGは0および6硫酸の比率が高いものであった。これらの結果を学会発表ならびに論文投稿の準備をしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究目標は植物由来PGの効率的な精製方法の確立である。植物由来PGは、アラビアゴム由来AGPの精製を行った。従来から行われているイオン交換クロマトによる分画法と疎水クロマトによる分画法を比較した。アラビアゴム中の糖鎖であるアラビノガラクタンは、非常に粘性が高くタンパク質と結合しているAGPを分離することが難しい。AGとAGPの電荷状態の違いでの分画において、陽イオンおよび陰イオン交換クロマト、疎水性クロマトでの分画を比較した。その結果、完全にAGとAGPの分画は出来なかったが、陽イオン交換および疎水クロマトを行うことで、タンパク質部分に富んだ画分の分離ができた。分画したAGPを皮膚線維芽細胞および表皮角化細胞に添加し、ヒアルロン酸を始めとした細胞外マトリックス産生に及ぼす影響について検討した。その結果、表皮角化細胞に添加することでヒアルロン酸産生に影響を与える可能性を確認することができた。
動物由来PGは、サメ頭部軟骨、シャケ氷頭、豚気管軟骨、クジラ鼻軟骨、トリヤゲン軟骨を原料として抽出し、イオン交換クロマトグラフィーで分画した。アグリカンが主であり、その構成するグリコサミノグリカン(GAG)はコンドロイチン硫酸であることを確認した。各PGのコンドロイチン硫酸に特異的な抗体（抗コンドロイチン硫酸抗体；C0S, C4S, C6S）を用いたウエスタンブロッティングの結果、サメおよびクジラ由来PGは、0, 4, 6硫酸に対する抗体に対して、同じように反応するのに対し、シャケ由来PGでは、0および6硫酸に対する抗体に反応した。豚由来PGでは4硫酸が多く、トリヤゲン軟骨PGの硫酸化部位は、豚由来のPGに似ている可能性が考えられた。グルコサミンの硫酸化の構成が似ているにもかかわらず、サメとシャケ由来PGに対する抗体反応の違いがあることは興味深い結果であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、動物・植物由来のプロテオグリカン(PG)を精製し、その構造的特徴を比較した。植物PGは、アラビアゴムから調製したアラビノガラクタン-プロテイン(AGP)の精製度を高めることを主軸に研究を進める。植物の細胞外マトリックスとしてセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、エクステンシンが存在する。陽イオン交換および疎水クロマトグラフィーを組み合わせることで、効率の良い精製を行う。そこで、次年度は、精製した植物由来PG
を皮膚細胞に添加し、ヒアルロン酸をはじめとした細胞外マトリックスの産生能を比較することを計画している。皮膚真皮線維芽細胞への動植物由来のPG添加実験では、細胞外マトリックスの中でもコラーゲンやヒアルロン酸産生能を中心に比較検討を行う。上皮角化細胞でのPG添加実験では、フィラグリン、アクアポリン、ヒアルロン酸などの保湿因子や抗菌ペプチド産生能への影響を検討する。皮膚細胞への添加効果が明らかになれば、化粧品原料としての可能性も高くなることから、PGおよびその分解物にも着目して研究を行う。また、動植物由来PGの構造の特徴を明らかにし、皮膚細胞への添加効果を指標としてPG分解物の大量調製方法も検討する。原料が安価な素材から、簡便な方法でPG分解物を得ることが出来れば、その用途として機能性食品としての利用にも広がる。
動物由来PGを精製する場合、前処理方法としてエタノールを多用することが一般的であるが、この方法では安価な製品の製造が難しく、また安全性の担保が難しくなる。そこで、陽イオンおよび疎水クロマトグラフィーで用いた吸着レジンを利用した簡便な精製方法を確立することを計画している。
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| Causes of Carryover |
昨年度の細胞添加実験において、使用した抗体の再利用が可能であったことから、安価に研究を進めることが出来た。今年度で、細胞の産生物の評価を多角的に行う事を計画している。
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