2022 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質工学およびケミカルバイオロジーを駆使したタンパク質分解系の開発
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22K05558
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
西村 浩平 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (80582709)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | オーキシン / タンパク質分解 / AID / TIR1 / ssAID / ナノボディ / AlissAID |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者が確立したAID法は標的とするタンパク質をオーキシン依存的に分解することが可能であり、様々な真核生物種において、標的とするタンパク質の迅速なノックダウン系として用いられている(Nishimura et al., Nature Methods, 2009)。しかしながら、TIR1の導入や標的タンパク質へのAIDタグの付加など、実験に先立ち行わなければならないことも多い。また、過剰量のオーキシンがもたらす細胞毒性の問題も、避けては通れない問題であった。このような状況の中、申請者は動物細胞で簡便にAID細胞株を作製する方法を確立し(Nishimura and Fukagawa, Chromosome Res, 2017)、また、勘案事項の一つであった過剰量のオーキシン問題も、OsTIR1F74A変異体と人工合成オーキシンである5-Ad-IAAとの組み合わせにより1/1000にまで減少させることに成功した(Nishimura et al., Nucleic Acids res, 2020)。本年はナノボディと呼ばれる小分子抗体をこのssAID法に組み込み、ナノボディが認識したタンパク質を分解するAlissAID systemの構築を行った。その結果、真核生物のモデル生物である出芽酵母細胞において、GFPやｍCherryなどの蛍光タンパク質を標的としたAlissAID systemの開発に成功した。出芽酵母細胞においてはGFPタグのクローンコレクションが存在しているため、これらの酵母株を利用することで簡便にAlissAID株を作製することができるため、このAlissAID systemは出芽酵母の分子遺伝学にとって重要なツールとなると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
既存のオーキシンデグロン法で標的タンパク質の分解を誘導するためには分解用のタグであるAIDタグを標的とするタンパク質に付加する必要がある。出芽酵母や一部の培養細胞では相同組換えにより、簡便にAIDタグを付加することが可能である。一方で、他の動物培養細胞や生物個体ではこのようなタンパク質へのタグの付加は難しいものも多い。そのため、AIDタグの付加を必要としないssAID法、すなわちAlissAID法の確立を試みた。この目的のために小分子抗体であるナノボディを利用した。ナノボディとAIDタグとを融合させ、この融合タンパク質の中からユビキチン化の標的となるリシン残基を取り除くことによって、このタンパク質はユビキチン化されず、ナノボディ によって認識された標的タンパク質がユビキチン化され、分解されるようになると考えられた。本研究ではまず、既知のナノボディであるGFPナノボディとGFP融合タンパク質を用いて、GFP融合タンパク質の分解が可能であるかを真核生物のモデル生物である出芽酵母細胞を用いて検証を行った。すると、細胞質や核に局在するGFP融合タンパク質を5-Ad-IAA依存的に分解することが可能であった。次に赤色蛍光タンパク質としてGFPとともに多用されるmCherryに対するナノボディを用いてmCherry融合タンパク質に対するAlissAID法の構築を行った。得られたデータをもとに論文を作成し、プレプリントサーバーであるBioRxivへとデポジットを行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年、確立した出芽酵母によるAlissAID法が動物の細胞においても機能するか検証を行う。また、上記の研究により、構築したAlissAID法により、内在性のタンパク質を標的とした分解系を構築するために、内在性の因子に対するナノボディの探索を行う。現在、ナノボディ を探索する方法としては、これを保有するリャマなどへの免疫による通常の抗体取得以外に、ファージや酵母の表層に抗体を提示させるディスプレイ法などが知られている。またこの他にもペプチドバーコード法によるナノボディ の探索法などが開発されている。そのため、これらの方法を用いることにより標的とするタンパク質に対するナノボディ の探索を行い、上記の分解誘導法に用いる。分解の標的としては核や細胞膜など多様な局在を持つタンパク質を標的とすることとで本分解システムの汎用性を確かめていく。本システムの特徴として、分解標的の認識を小分子抗体により担わせる点にある。既存のタンパク質分解法であるAID法、MGD、PROTACではタンパク質の修飾状況にかかわらず、全てのタンパク質が分解の標的となってしまう。しかし、本システムでは修飾がなされたタンパク質のみに対する小分子抗体を取得することができれば、修飾されたタンパク質のみを標的として分解誘導することが可能となる。
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| Causes of Carryover |
コロナによって海外渡航が規制され、希望していた国際学会への参加を見送らなければならなかった。また、共同研究ベースでの研究が増加したことにより、物品購入費が当初の計画よりもだいぶ抑えられた。次年度使用分との合算はかなりの金額になってしまうため、次年度中に使い切ることは考えておらず、研究期間の延長なども視野に入れた資金計画を立てる予定である。
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Research Products
(3 results)
