2022 Fiscal Year Research-status Report
米のアミロース含量ファインチューニングを目指したWaxy遺伝子発現制御機序の解明
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22K05591
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
濱田 茂樹 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (90418608)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | イネ / 澱粉 / アミロース / 突然変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食料自給率向上の観点から米の新規用途や高付加価値米の開発が求められるなかで、特に冷めても硬くなりにくい特徴を有する低アミロース米は、業務用米での利用拡大が期待される。これまでイネの低アミロース形質を制御する複数の遺伝子が同定されてきたが、他にも多くの未同定の新規制御遺伝子の存在が考えられている。本研究では、新たな低アミロース性遺伝資源の探索およびデンプン生合成のメカニズム解明を目的とした。つがるロマンを原品種とする突然変異集団から、外観およびヨウ素染色法を用いて低アミロース系統を選抜した結果、白濁した外観を示し、見かけのアミロース含量が約 6 ％ を示す突然変異系統 Amy41 が選抜された。本課題では、この低アミロース性突然変異系統について、原因遺伝子の同定およびデンプン生合成関連遺伝子群の発現解析, デンプン構造を明らかにした。次世代シークエンス解析および SNaPshot 法によるフラグメント解析から、Amy41 の原因遺伝子が Serrate RNA effector molecule 遺伝子 (OsSerrate) であると同定した。Amy41登熟種子中のアミロース合成酵素 GBSSI のタンパク質レベルの発現は、つがるロマンと比べ大幅に減少していることが明らかとなった。さらに、real-time PCR により、他のデンプン生合成関連遺伝子にも転写レベルの発現に影響が見られた。キャピラリー電気泳動によるアミロペクチンの鎖長分布解析から、Amy41 では短鎖の割合が減少し、中長鎖の割合が増加していた。以上の結果から本研究では、GBSSI の発現およびアミロペクチン合成に関与する新規制御因子の同定に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和４年度の研究では、これまでに選抜された低アミロース性変異系統 Amy41 について突然変異原因遺伝子の絞り込みおよびデンプン構造解析を計画した。戻し交配後代 F2 の分離集団を用い、次世代シークエンス解析および SNaPshot 法によるフラグメント解析で原因遺伝子の解析を行なった。その結果、Amy41 の原因遺伝子は、低アミロース性の表現型と遺伝型が完全に一致した Serrate RNA effector molecule 遺伝子 (OsSerrate) であると同定した。その SNP は pre-mRNA のスプライシング認識部位に存在し、RT-PCR およびシーケンス解析から、成熟 mRNA 中における第 11 イントロン挿入による自身の C 末領域の欠失が確認された。Amy41 登熟種子中におけるアミロース合成酵素 GBSSI のタンパク質発現レベルは、つがるロマンに比べ大幅に減少していることが明らかとなった。そこで、GBSSI の mRNA 発現を解析すると、GBSSI 遺伝子の第 1 イントロンが正常にスプライシングされた転写産物が減少していた。一方で、GBSSI mRNA 全体の発現量には変化がなかった。このことは、OsSerrate の機能欠失が選択的スプライシングによる GBSSI の転写後制御に影響することで、アミロース含量に変化を与えていることを示すものである。さらに、real-time PCR を用いて他のデンプン生合成関連遺伝子についても転写レベルの発現に影響が見られ、それに伴いアミロペクチンの鎖長分布においても、Amy41 では短鎖の割合が減少し、中長鎖の割合が増加していることが確認された。以上のように、当初の計画に従い実験が行われ、予定通りの結果が出ていることから、順調に進展しているものと判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和４年度実施した研究によって同定された OsSerrate が、どのようなメカニズムでアミロース合成酵素のスプライシング制御を行っているのか不明である。変異体において、OsSerrate の C 末領域の欠失がタンパク質機能にどのような影響を与えているのか、既知の低アミロース誘導性タンパク質との相互作用に着目して解析を進めていく予定である。また、これまでの Wx 遺伝子のスプライシング制御はジャポニカタイプ Wxb においてのみであることから、同定された OsSerrate がインディカタイプの Wxa にも何らかの影響を示すのか解析する。そのための Wxa 品種との交配は既に行い、F2 分離集団は準備している。これらの後代についてアミロース含量と遺伝子型の相関を確認するとともに、Wxa 遺伝子の発現解析を行う。さらに、本研究ではもう１種の低アミロース性変異系統を選抜済である。この変異系統についても、同様に原因遺伝子の同定を進めていく。次世代シークエンスによる候補遺伝子の結果をもとに、CAPS 法あるいはフラグメント解析を用いて同定を試みる。これらの成果は、アミロース合成酵素の選択的スプライシングの作用機序の理解を深めるだけでなく、今後の多様な遺伝資源の確保にも繋がる。
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