ウリ科植物の巻きひげ分化の分子機構の解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05627
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 園田 雅俊 千葉大学, 大学院園芸学研究院, 講師 (70376367)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 巻きひげ / TCP転写調節因子 / MIKC型MADS転写調節因子

Outline of Annual Research Achievements

巻きひげは、ウリ科をはじめとする一部の植物において体を支持する重要な器官である。一方、整枝誘引作業の邪魔になるため、巻きひげを持たない施設栽培に適した農業省力化用品種作出の要望があり、このためには巻きひげ形成の分子機構解明が必要である。これまでの我々の研究で、ウリ科植物の巻きひげが腋芽由来であり、巻きひげの形成にCmTCP1転写調節因子が関与することを明らかにしてきた。しかしながら、巻きひげ分化の初期過程は不明である。本研究では、CmTCP1転写調節因子の巻きひげ特異的発現を制御する転写調節因子を同定し、さらにこの転写調節因子と、腋生分裂組織の形成や側枝形成に関わる転写調節因子との関係を明らかにすることで、巻きひげ分化の初期過程を明らかにすることを目指す。
本研究によりこれまでにCmTCP1遺伝子上流のシスエレメントに結合するMIKC型MADS転写調節因子を同定した。しかし、一過的発現解析により同因子だけではCmTCP1を発現誘導出来ないことが明らかになった。MIKC型MADS転写調節因子のプロモーター配列情報からGRAS転写調節因子が同遺伝子の発現抑制に関わっている可能性が考えられた。最終年は、CmTCP1転写調節因子の巻きひげ特異的発現に関与するMIKC型MADS転写調節因子のDNA結合配列の特定、同遺伝子と腋生分裂組織の形成や側枝形成に関わる転写調節因子のメロンのオーソログ遺伝子との時空間的発現解析並びに相互作用の解析を進めており、3年目に巻きひげ分化の初期過程におけるこれら因子の関係性に関して国際論文等に公表する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

巻きひげ形成に関与するCmTCP1転写調節因子の発現制御に関し、１年目の解析では同遺伝子の巻きひげ特異的発現関わるシスエレメントに結合するMIKC型MADS転写調節因子を明らかにしている。２年目は、以下の３つの点に関して明らかにすることを目指して研究を行った。①MIKC型MADS転写調節因子のDNA結合配列を同定する。②CmTCP1及びMIKC型MADS転写調節因子、腋芽初期形成に関わる遺伝子の時空間的発現解析を行うことで、これら因子の関係性を調べる。③MIKC型MADS転写調節因子の転写活性化能を明らかにする。①では、１年目の研究で大腸菌タンパク質発現系を用いてリコンビナントタンパク質の作製を試みたが発現が見られなかったため、２年目の研究では発現ベクターや宿主を変えたことで目的タンパク質の発現が見られるまでになったが、可溶化出来ず、解析に至っていない。②では、In situ hybridization法を用いているが、シグナル強度の問題でCmTCP1転写調節因子やMIKC型MADS転写調節因子と他の因子の相関を明確にすることが現状出来ていない。③では、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として、CmTCP1のプロモーター配列と連結したプラスミドとMIKC型MADS転写調節因子をタバコモザイクウィルス由来35Sプロモーターで過剰発現させるプラスミドをタバコの葉にパーティクルボンバーメント法で導入し、一過的な発現解析を行うことで調べた。MIKC型MADS転写調節因子だけでは発現せず、他の因子が転写活性化に必要であることが推測された。CmTCP1の巻きひげ特異的発現に関与するシスエレメントに結合するMIKC型MADS転写調節因子のプロモーター配列からGRAS転写調節因子が同遺伝子の発現抑制に関わっている可能性が考えられた。

Strategy for Future Research Activity

2年目までの解析で明確に出来なかったin situ hybridization法による発現の時空間的解析について、プローブ側の問題である可能性が高いため、プローブサイズを変えることなどを中心に、更に条件検討を加えることで目的を達成したい。またリコンビナントタンパク質の可溶化の問題に関しては、発現誘導の温度やIPTG濃度の再検討を行うとともに、それでも可溶化しない場合は、In vitroタンパク質発現法を用いてMIKC型MADS転写調節因子を作製し、SELEX法、その後ゲルシフト法を行うことで配列決定を行う。得られた配列情報を基に、メロンのゲノムデータベースを検索し、発現誘導する可能性のある遺伝子群を提示したい。一過的発現解析を用いたMIKC型MADS転写調節因子の転写活性化能の検討では、同遺伝子だけでは転写活性化する可能性が低く、他の因子と相互作用することでCmTCP1の発現誘導をしている可能性があることが考えられたため、酵母Two-Hybrid法を行い、相互作用する因子を探索する。新規遺伝子が見つかった場合は、その遺伝子の配列特性から機能を推測して適切な解析を行う。これらで得られた情報をまとめて国際論文で研究成果を発表する予定である。