ビフィズス菌とキサントモナス属細菌に共通して存在する新規糖鎖分解酵素郡の機能解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05655
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 中村 正幸 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (90404475)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: Xanthomonas / 糖鎖分解酵素 / 病原性(力)

Outline of Annual Research Achievements

令和4年度は、ウリ類褐斑病細菌(Xcu)に認められるビフィズス菌由来HypBA1およびHypBA2のホモログのクローニングと大腸菌を用いた組換えタンパク質発現を行い、それぞれの基質特異性について調査を行った。HypBA1のホモログは、Xcuのゲノム上に2つ存在していたことから、それぞれをXcuHypBA1-1とXcuHypBA1-2とし、pET-23bを用いてクローニング後、大腸菌でタンパク質を発現させたところ、いずれも可溶化タンパク質を得ることができた。そこで、これらの基質特性を調べたところ、XcuHypBA1-1は、1つのアラビノース(Ara)とヒドロキシプロリン(Hyp)が結合したAra-HypからAraを遊離することが分かった。一方、XcuHypBA1-2は、Ara-Hypに加え、Ara2-Hypにも作用することが分かった。ビフィズス菌由来HypBA1は、Araが2つ結合したβ-Ara2に作用することから、Xcu由来のHypBA1は、ビフィズス菌のものと機能が異なることが分かった。次に、XcuHypBA2のタンパク質発現を試みたところ、pET-23bではタンパク質が発現しなかったことから、pCold-TFを用いて融合タンパク質で発現させたところ可溶化タンパク質を得た。基質特性を調べたところ、Ara3-Hypからβ-Ara2を遊離することが分かった。これは、ビフィズス菌由来のHypBA2と同じ機能であった。XcuHypBA2をコードしている上流には、病原性遺伝子の転写に関わる因子(HrpX)が結合する領域(PIP-box)が認められたことから、XcuをHrpX誘導培地で培養し、遺伝子発現解析を行ったところ、XcuHypBA2遺伝子の発現が促進されることが分かった。つまり、Xcuが植物に感染する際、本遺伝子の発現がHrpXにより誘導されることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

アラビノオリゴ糖鎖分解に中心的に機能すると予想されていたXcuHypBA1-1、XcuHypBA1-2およびXcuHypBA2の組換えタンパク質発現に成功し、それぞれの基質特性を特定することができた。また、XcuHypBA2の遺伝子発現は、病原性遺伝子発現に重要な転写因子であるHrpXにより制御されている可能性も明らかにできた。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度は、残りの酵素であるXcuHypAAの組換えタンパク質発現と機能解析ならびに各酵素遺伝子の破壊株を作出することで、これら酵素群と病原性(力)との関わりを明らかにする。合わせて、病原性遺伝子発現に関与するXrpXの遺伝子破壊株も作出し、宿主上での各酵素遺伝子の発現パターンを定量PCRにより野生株と比較解析を行う。