2022 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of insect developmental timing by circadian rhythm signaling pathways.
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22K05674
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
岩見 雅史 金沢大学, 生命理工学系, 教授 (40193768)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木矢 剛智 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (90532309)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | カイコ / PTTH / PDF / 神経活動 / vrille / 概日リズム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫の幼虫は各齢で十分なサイズに達してから次の齢へと脱皮・変態し，栄養不足などで成長が遅れた場合には脱皮のタイミングも遅延する。しかし，発生タイミングが内外の環境によって適応的に制御される機構の全貌は不明である。昆虫の後胚発生では，脳で作られる前胸腺刺激ホルモン（PTTH）は脱皮・変態のタイミングを制御する最重要因子である。これまでの研究から，脱皮・変態のタイミングを制御するPTTHを生合成するPTTH細胞には個体の内外の情報が集約し，その生理特性（興奮性）に反映される機構があること，その制御には概日リズムのシグナル経路が重要であることを見出してきた。よって，PTTH細胞の神経活動の制御機構の解明こそが，昆虫の脱皮・変態タイミングの制御機構の解明に重要であるといえる。そこで，PTTH細胞の神経活動が個体の内外の環境に対して適応的に制御する機構を，概日リズムのシグナル経路に着目して解明することを本研究の目的とした。
初年度は，ショウジョウバエを用いてPTTH細胞においてvrille (vr)をノックダウン・過剰発現させた個体を作出し，発生における影響を調べた。結果，vrのノックダウンや過剰発現では発生に影響は全くなかった。次に，PDF受容体（PDFR）をノックアウト（KO）したカイコガ系統を樹立し，発生における影響を検討した。予想に反し，PDFR KOカイコは野生型に比べて多少の体重差があったが発生遅延などの明確な表現型は認められなかった。また，PDFR KOの遺伝的背景においてPTTH細胞にGCaMP6fを発現させた系統を用い，PTTH細胞の神経活動の概日リズム解析に取り組んだ。
これらの結果を踏まえ、今後はvr KOカイコを作出するのではなく、PTTH細胞の神経活動に着目して研究を進めてゆくこととした。加えて，ショウジョウバエを用いてPTTH細胞の解析を行うことにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１. ショウジョウバエを用いたvrilleの解析
これまでの研究より，本研究者らは，カイコ幼虫のPTTH細胞にはPDF受容体が選択的に発現することや，血中エクジソン濃度増加に応答してvrille（vr）が発現誘導されることを見出してきた。カイコにおいてノックアウト（KO）系統を作出することは時間・労力共にかかること，vr変異体のショウジョウバエは致死となることから，まずはショウジョウバエを用いてPTTH細胞特異的にvr機能を解析し，何かしらの表現型が認められた場合にカイコにおいて解析する計画とした。PTTH細胞においてvrをノックダウン・過剰発現させたショウジョウバエ個体を作出し，発生における影響を調べた。この際，以前に行ったスクリーニングによって同定したbroad (br), Ecdysone receptor (EcR)についても同様の解析を行った。その結果，PTTH細胞選択的にvrをRNAiノックダウンしても，過剰発現しても，発生における影響は全く認められなかった。一方，brやEcRのRNAiノックダウンでは，発生遅延および蛹期での致死といった表現型が再現されたが，brの各サブタイプZ1-Z5をそれぞれ過剰発現しても，発生における表現型は認められなかった。
２. PDFR KOカイコを用いた解析
PDFR KOカイコ系統を樹立したので，その発生過程における各齢の日数や5齢以降の体重について詳細に表現型を解析した。PDF KOの表現型とは異なり，PDFR KOカイコは野生型に比べて多少の体重差があるものの，発生遅延などの明確な表現型は認められなかった。次に、，TTH細胞の神経活動の概日リズムにおけるPDFRの役割を明らかにするために，PDFR KOの遺伝的背景においてPTTH細胞にGCaMP6fを発現させた系統を樹立した。
上記より，おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．PTTH細胞におけるbrの機能解析
初年度の結果を踏まえ，vr KOカイコを作出して解析することは中止し，明確な表現型の認められたショウジョウバエのPTTH細胞におけるbrの機能解析を進める。PTTH細胞においてEcRの機能が必要であることは，他のグループに先行されてしまったが，EcR経路の下流については報告されていない。様々なEcR下流因子について解析したところ，brのみがEcR阻害と同様の表現型を示したことからbrを介した経路が重要であると予想される。PTTH細胞においてbrをRNAi阻害した個体において，エクジソンシグナリング経路がどのように変化しているか調べ，EcRの下流として機能していることを明らかにする。
２．PTTH細胞の神経活動の解析
PDFR KOの遺伝的背景においてPTTH細胞にGCaMP6fを発現させたカイコ系統を樹立したので，この系統を用いて，PTTH細胞の神経活動の概日リズムにどのような変化が生じているか調べる。これによりPDFRを介したシグナルがPTTH放出に果たす役割を明らかにする。また，PTTH細胞にGCaMP6fを発現させ，アラタ体において神経活動を可視化できるショウジョウバエ系統を作出したので，この系統を用いて、カイコと同様に，PTTH細胞の神経活動に概日リズムがあるかといったことの調査や候補遺伝子の機能解析を行う。
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| Causes of Carryover |
カイコの飼育に必要な餌や実験に必要な試薬を節約するなどした結果，少額の次年度使用が発生した。これは餌や試薬の購入タイミングによるものであり，次年度の予算と合わせて計画通り使用する予定である。
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