Remediation of PPCPs by macromolecular lactone degrading bacteria

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K05941
• Research Institution: Tokyo University of Technology
• Principal Investigator: 松井 徹 東京工科大学, 応用生物学部, 教授 (90372812)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: エチレンブラシレート / 微生物分解 / スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

１．エチレンブラシレート（EB）分解菌のスクリーニング
八王子市高尾山周辺地域より土壌、植物等の環境試料を採取し、EBを炭素源とした集積培養によりEB分解菌のスクリーニングを行った。EBを唯一の炭素源として、120の土壌試料から50株程度の候補株を分離した。さらに、安定な生育を示す菌を10株選抜した。16SrRNA遺伝子全長解析し、DDBJ/NCBI/EMBL登録を行った。(それぞれ、EB4h, EB10e, EB10f, EB10h, EB11a, EB11i, EB11j, EB11k, EB11L (accession number LC756462~756471)として登録)。同定の結果、β-proteobacteria, γ-proteobacteria, Actinomycetes, Firmicutes (Bacillus sp.) と多様な細菌が得られた。さらに海洋中に拡散した汚染物の分解を目的として高塩濃度下での分解菌スクリーニングを開始した。
２．分解代謝物の解析
新規に分離した菌株のEB分解経路を明らかにすることを目的に、培養抽出液からの分解代謝物検出を試みた結果、良好な生育が見られた培養抽出液からGCMSにより代謝物と思われるピークがほとんど認められなかったことから、速やかな分解が起こっていると考えられた。そこで、休止菌体反応によりEB分解反応を行ったところ、エステル化処理試料に大きな分解代謝物ピークが認められ、ブラシル酸ジメチルエステルと同定された。さらに反応液上清を水層分析用GCカラムにより分析したところ、エチレングリコールと同じ保持時間にピークが認められた。以上より、分離株はEBをリパーゼ等のエステル分解酵素によりブラシル酸とエチレングリコールに分解していることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１．エチレンブラシレート（EB）分解菌のスクリーニング：安定した生育を示す多様なEB分解細菌が得られたことから、詳細な検討を進める基盤ができたといえる。高塩濃度条件下での分解菌スクリーニングも分解菌取得のめどが立ったことから、八王子市の主催する学生発表会にて報告を行った。詳細な解析を進める予定である。２．分解メカニズムの解明：休止菌体法を適用することにより分解産物の同定を行うことができた。各種大環状ラクトン化合物に関する分解スペクトルを検討するとともに、次世代シーケンサによるゲノム解析を進め、分解関連遺伝子の解明を行う。
以上のことから、当該年度計画事項に関しては概ね順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

１．分解関連遺伝子解析－ＥB分解菌および高塩濃度EB分解菌について次世代シーケンサによるゲノム解析を行い、その結果から、エステル分解酵素遺伝子の抽出、遺伝子組換えによる発現と分解特性検討を行う。各種大環状ムスク化合物分解性との相関を行い、リパーゼと分解活性相関を明らかにする。
２．分解活性の向上－分離菌は、糖類を用いた場合においても十分な分解活性を有することから、高密度培養を目的とした培養条件の最適化と分解活性の向上を目指す。具体的には、温度、pH等の基本条件に加え、生育炭素源、培地組成の最適化を行う。
３．分解微生物群による複合基質の分解－環境中での分解挙動を知るために、基質を混合し、本研究での分解菌を用いた複合基質の分解経過を解析する。各種基質の分解の優先順位、分解微生物を混合した場合の残存性と培地組成の関係を明らかにする。

Causes of Carryover

コロナ禍により学会発表を控え、市内発表会としたため、学会参加費分が減少した。また、培養抽出物解析による代謝中間体の構造を速やかに決定できたため、分析関連経費が抑えられた。
次年度は、分解メカニズム解明を目的とした分離菌のゲノム解析を積極的に実施すると共に、代謝中間体の分析のために使用するHPLCポンプ等の新規購入が必要となる。
次年度使用計画（概算）学会参加（国内2名、1回）100,000（計画通り）、消耗品等1,300,000（計画増）、計1,400,000