2022 Fiscal Year Research-status Report

ウシ乳汁エクソソームにより活性化されるオートファジーの役割解明

Research Project

Project/Area Number	22K05975
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	相澤修日本大学, 生物資源科学部, 講師 (10645899)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	母乳 / エクソソーム / オートファジー / 腸管上皮細胞
Outline of Annual Research Achievements	エクソソームは細胞から分泌される膜小胞であり、生体内では血液をはじめとするあらゆる体液中に存在することが知られている。哺乳動物の新生児（仔）にとって唯一の栄養源である母乳におけるエクソソームの存在もマウスやヒトをはじめ多くの動物種で確認されている。このことは、生体内における細胞間情報伝達のみならず母乳を介した母親-新生児（仔）間の情報伝達にもエクソソームが関与することを示唆するものである。また、ウシに関しても母乳にエクソソームが含まれていることが多数報告されており、動物種間におけるmiRNA配列の高い保存性から、食品として牛乳を摂取したヒトにおけるエクソソーム内miRNAを介した生理機能調節作用が期待されている。申請者は、ウシ乳汁エクソソームの機能を探索する過程において、腸管上皮細胞株のオートファジーを活性化させることを見出した。本研究では、腸管組織におけるウシ乳汁エクソソームのオートファジー活性化の分子機構と生体内における存在、および腸管組織の恒常性維持におけるその役割を明らかにすることを目的とする。今年度は、ウシ乳汁から超遠心分離法を用いて効率的にエクソソームを単離する方法を開発し、さらにオートファジー活性化の分子機構に関してmiRNAに着目して検討を行った。ウシ生乳から単離・精製されたエクソソーム分画より得られたRNAを用いて次世代シーケンサーによる網羅的かつ定量的解析を行った。その結果、乳汁エクソソームは特徴的なmiRNA含有パターンを示すことが明らかとなった。現在、腸管上皮細胞株における上記のmiRNA群の標的遺伝子発現について解析中である。また、生体における乳汁エクソソームによるオートファジー活性化の存在を明らかにするための準備として、マウス腸管組織におけるオートファジーマーカータンパク質の染色法に関して条件検討を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ウシ乳汁より単離・精製されたエクソソームに含有されるmiRNAを解析した結果、特徴的なmiRNA含有パターンを示すことが明らかになり、当初の計画通りオートファジー活性化の分子機構の一端を明らかにすることができた。現在はそれらmiRNA群の機能に関して培養細胞を用いて解析中である。また、生体レベルにおける乳汁エクソソームによるオートファジー活性化の存在を示す実験についてもすでに着手しており、マウス腸管組織を用いて複数のオートファジーマーカータンパク質の染色条件を確立することができた。
Strategy for Future Research Activity	令和5年度は、第一に生体における乳汁エクソソームによるオートファジー活性化の存在を明らかにする。マウスに対してウシ乳汁エクソソームを経口投与し、腸管組織をLC3タンパク質などのオートファジーマーカータンパク質に対する抗体で免疫染色することにより、培養細胞レベルで明らかとなった乳汁エクソソームによるオートファジー活性化を生体レベルで示すことを目標とする。加えて、炎症性腸疾患の培養細胞モデルを用いて乳汁エクソソームの病態改善効果について追究することにより、腸管組織の恒常性維持におけるその役割を明らかにする。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由としては、マウス腸管組織の染色に用いたいくつかの抗体が特異性等の問題により計画通り進行しなかったためである。次年度使用額は、主に計画通りに進行しなかった上記実験のために使用する。したがって、上記実験に関連する生化学・分子生物学的解析に用いる消耗品やプラスチック器具類、ガラス器具類などを購入する予定である。実験設備は整っているため、現在のところ設備備品の購入予定はない。