脊椎脊髄内リンパ管の形態、機能解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K06042
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 松山 幸弘 浜松医科大学, 医学部, 教授 (20312316)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 脊髄 / リンパ管

Outline of Annual Research Achievements

リンパ管の役割は、組織液や老廃物の輸送などが知られている。中枢神経系には長年リンパ管はないとされてきたが、近年その存在が確認され注目を浴びている。しかし脊髄内のリンパ管の存在は認められておらず、物質がどのようにドレナージされていくかは未だ不明な点が多い。本研究では脊髄実質内に注入した物質がどのような部位を通ってドレナージされていくか、リンパ管マーカーに注目して解析した。
脊髄内の脈管構造がリンパ管であることを証明するためには、血管ではないことを証明する必要がある。リンパ管マーカーとしてProx1、Podoplanin、Lyve1、VEGFR3が知られている (Jerome et al, Compr Physiol, 2019)。我々はそれらのプロモーターマウスであるProx1-GFP遺伝子改変マウス、及びVEGFR3-VENUS遺伝子改変マウスを入手した。また血管可視化マウスとしてVEGFR1-dsRedおよびVEGFR2-EGFP遺伝子改変マウスも入手しており、交配させることによりリンパ管、血管を同時に可視化できるマウスを作成している。
8-16週齢のWTマウス、及びVEGFR1-dsRed遺伝子改変マウスを使用した。マウスから脊髄を取り出し、リンパ管マーカーを観察した。また、脊髄実質内にトレーサーとしてOVA-647を2μl注射し、15分後に還流固定を行い、局在を観察した。三次元の観察としてCUBIC-R＋による透明化手法を用い、共焦点顕微鏡および光シート顕微鏡で観察を行った。また二次元での観察として脊髄の切片を免疫染色し共焦点顕微鏡、及び透過型電子顕微鏡で観察した。
脊髄実質内に、リンパ管マーカーであるLYVE1を発現する脈管構造がみられ、またLYVE1はVEGFR1を発現する比較的太い血管の周囲に発現していた。また同構造はミクログリアマーカーであるCD68、Iba1も発現していた。免疫電子顕微鏡では、LYVE1は血管周囲の膜、及び細胞構造に発現していた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上述の通り、リンパ管マーカーであるLYVE1を発現する脈管構造を確認し、LYVE1はVEGFR1を発現する比較的太い血管の周囲に発現することも確認した。また同構造はミクログリアマーカーであるCD68、Iba1も発現していた。免疫電子顕微鏡では、LYVE1は血管周囲の膜、及び細胞構造に発現していた。今後、脊髄実質内に注射したLYVE1-Alexa594トレーサーが吸収される経路を調べていく。

Strategy for Future Research Activity

LYVE1-Alexa594トレーサーの実験を三次元解析で行い、トレーサーの集積する部位などを観察する予定である。また、LYVE1の発現部位との関係を明らかにする。